[發明專利]一種用于檢測引起牛腹瀉病病毒性病原的多重實時熒光PCR檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202211320405.4
• 申請日: 2022-10-26
• 公開（公告）號: CN116064957A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 徐義剛;韓言言;王美;李園;姜勝;宋厚輝
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

本發明公開了一種用于檢測引起牛腹瀉病病毒性病原的多重實時熒光PCR檢測試劑盒及其應用。所述的引起牛腹瀉病病毒性病原包括牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒和牛細小病毒，所述的多重實時熒光PCR檢測試劑盒含有分別用于檢測上述病毒的實時熒光PCR引物對以及SYBRGreen染料。本發明通過基因序列比對分別針對上述4種病毒靶基因的高度保守區域設計特異性引物，經過反應條件優化，建立了同時檢測4種病毒的多重SYBRGreen實時熒光PCR方法。該方法的檢測靈敏性顯著高于常規PCR方法，同時具有良好的檢測特異性和重復性，為BVDV、BCoV、BRV和BPV的快速鑒別診斷提供了技術手段。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測引起牛腹瀉病病毒性病原的多重實時熒光PCR檢測試劑盒及其應用，特別涉及一種用于檢測牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛冠狀病毒(BCoV)和牛細小病毒(BPV)的多重實時熒光PCR檢測試劑盒及其應用。本發明屬于生物技術領域。

背景技術

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine?Viral?Diarrhea?Virus，BVDV)、牛冠狀病毒(BovineCoronavirus，BCoV)、牛輪狀病毒(Bovine?rotavirus，BRV)和牛細小病毒(Bovineparvovirus，BPV)是引起牛腹瀉病的主要病毒性病原，臨床癥狀均以腹瀉為主要特征，而且多呈混合感染，臨床鑒別困難。目前已有檢測BVDV、BRV、BPV的單重實時熒光PCR方法及檢測BVDV+BPV+BPIV、BVDV+IBRV+FMDV、牛星狀病毒+牛病毒性腹瀉病毒+牛冠狀病毒+牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒+牛傳染性支氣管炎病毒+口蹄疫病毒的多重實時熒光PCR方法。

由BVDV、BCoV、BRV和BPV引起的牛腹瀉病，臨床癥狀相似，而且常發生混合感染，臨床診斷困難。現有的單重PCR檢測方法雖然可以達到鑒別檢測的目的，但是比較費時費力；此外，目前尚缺乏有效的可同時快速鑒別檢測上述4?種病毒的方法。

本發明基于多重PCR方法通量高的優勢及熒光染料SYBR?Green的靈敏性，建立了檢測BVDV、BCoV、BRV和BPV的四重實時熒光定量PCR方法，并組裝了檢測試劑盒，為臨床快速鑒別診斷、疫情監測和流行病學調查提供了必要的技術手段。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測引起牛腹瀉病病毒性病原的多重實時熒光PCR檢測試劑盒及其應用。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：

本發明的一種用于檢測引起牛腹瀉病病毒性病原的多重實時熒光PCR檢測試劑盒，所述的引起牛腹瀉病病毒性病原包括牛病毒性腹瀉病毒(Bovine?Viral?DiarrheaVirus，BVDV)、牛冠狀病毒(Bovine?Coronavirus，BCoV)、牛輪狀病毒?(Bovine?rotavirus，BRV)和牛細小病毒(Bovine?parvovirus，BPV)，其特征在于，所述的多重實時熒光PCR檢測試劑盒含有分別用于檢測牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒和牛細小病毒的實時熒光PCR引物對以及FastStart?Universal?SYBR?Green?Master；

其中，用于檢測牛病毒性腹瀉病毒的實時熒光PCR引物對由SEQ?ID?NO.1?所示的上游引物以及SEQ?ID?NO.2所示的下游引物組成；

其中，用于檢測牛冠狀病毒的實時熒光PCR引物對由SEQ?ID?NO.3所示的上游引物以及SEQ?ID?NO.4所示的下游引物組成；

其中，用于檢測牛輪狀病毒的實時熒光PCR引物對由SEQ?ID?NO.5所示的上游引物以及SEQ?ID?NO.6所示的下游引物組成；

其中，用于檢測牛細小病毒的實時熒光PCR引物對由SEQ?ID?NO.7所示的上游引物以及SEQ?ID?NO.8所示的下游引物組成。