[發明專利]一種利用凝乳酶輔助提取山羊乳細胞外囊泡的方法

在審

• 申請號: 202211312310.8
• 申請日: 2022-10-25
• 公開（公告）號: CN115678829A
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 安小鵬;宋宇軒;張磊;江悅;朱俊儒;李廣
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 黃明光

本發明提供了一種利用凝乳酶輔助提取山羊乳細胞外囊泡的方法，屬于生物技術領域。本發明利用凝乳酶去除山羊乳中的酪蛋白，采取超速離心法提取山羊乳細胞外囊泡粗產物，再加入蔗糖墊進行純化，獲得了高純度、高質量的山羊乳細胞外囊泡。本發明還提供了利用上述方法提取的山羊乳細胞外囊泡，促進了對山羊奶細胞外囊泡具體功能的研究和應用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種利用凝乳酶輔助提取山羊乳細胞外囊泡的方法。

背景技術

細胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EV)是由細胞分泌的一種沒有復制能力的納米顆粒，它們存在于各種生物液體中，并已經被證實在細胞間通信中發揮關鍵作用。

細胞外囊泡在不同細胞類型之間起著交換運輸蛋白質、脂質、miRNA或DNA的作用，目前已經被證明在腫瘤轉移、組織再生等過程中發揮重要作用，并已被提出作為不同疾病的預后標志物。例如近年來研究較為廣泛的間充質干細胞(MSC)來源的EV具有與MSC相似的生物學效應，如減少細胞凋亡、減輕炎癥反應、促進血管生成、抑制纖維化、提高組織修復潛力等，而且易提取、改造，與干細胞移植相比致腫瘤風險低，在損傷修復的生物學治療中具有廣闊應用前景。目前各種細胞培養液上清等來源的細胞外囊泡較難獲得且提取后濃度較低，難以大批量生產使用，由于EV的體積非常小，對其分離、觀察和鑒定具有一定的挑戰性，尋找高效的EV分離和鑒定方法是研究的前提。

在可能的來源中，乳汁無毒無害且易于獲得，可以從中獲得高產量、無害和成本效益的細胞外囊泡，因此探究從乳中提取高質量的細胞外囊泡方法具有重大意義。目前針對人乳、牛乳、豬乳、駱駝乳中細胞外囊泡的研究較為廣泛，其無毒性和非免疫原性在健康模型中已被證實，且有研究證明可以作為預防藥物載體的廣泛應用。而針對山羊奶細胞外囊泡的相關研究還較為缺乏，對于山羊奶細胞外囊泡的具體功能也尚未見報道。

目前提取乳細胞外囊泡的方法運用較多的為超速離心法，但是提取得到的細胞外囊泡純度不高，效果不好。在不需要使用超高速離心機的方法中使用較多的則是密度梯度離心法和試劑盒提取法，密度梯度離心操作復雜、耗時長且提取純度較低，另外試劑盒提取法由于提取效率較低且價格昂貴，導致在行業內的認可程度也不高。特別是在乳源細胞外囊泡的相關研究中，如何穩定的得到高濃度高純度的細胞外囊泡是一個有待解決的重要問題。因此開發一種提取高質量山羊乳細胞外囊泡的方法具有重要意義。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種利用凝乳酶輔助提取山羊乳細胞外囊泡的方法，能夠減少提取的細胞外囊泡中的乳蛋白，同時能夠保護細胞外囊泡的完整性以及細胞外囊泡中生物大分子的活性。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種利用凝乳酶輔助提取山羊乳細胞外囊泡的方法，所述方法包括以下步驟：

取乳樣上清A，加入凝乳酶后，按照2000-3000g的轉速離心收集上清B；

將所述上清B于4℃，按照80000-120000g的轉速離心30-40min，收集上清C，使用微濾膜過濾，收集濾液D；

將所述濾液D于4℃，按照80000-120000g的轉速離心60-80min，收集沉淀F即為細胞外囊泡粗產物；

將所述細胞外囊泡粗產物重懸，獲得的細胞外囊泡重懸樣本加到蔗糖墊上，于4℃，按照80000-120000g的轉速離心60-80min；

取出所述蔗糖墊，稀釋后，于4℃，按照80000-120000g的轉速離心60-80min，去除上清，所得沉淀即為山羊乳細胞外囊泡。

可選的，所述凝乳酶的使用濃度為0.03-0.05mg/mL，添加量為1.75mg/50mL乳液上清。