[發明專利]用于多交叉恒溫擴增結合納米生物傳感檢測肺炎支原體的引物組合和檢測肺炎支原體的方法

在審

• 申請號: 202211306688.7
• 申請日: 2019-03-19
• 公開（公告）號: CN115807062A
• 公開（公告）日: 2023-03-17
• 發明（設計）人: 申阿東;王亞翠;焦偉偉
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京兒童醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 北京恒律知識產權代理有限公司 11416
• 代理人: 任霜

本發明公開了一種多交叉恒溫擴增結合納米生物傳感檢測肺炎支原體的引物組合，所述引物組合能夠針對肺炎支原體P1基因進行特異性擴增。本發明還公開了多交叉恒溫擴增結合納米生物傳感檢測肺炎支原體的方法，可以在30分鐘內完成整個MCDA擴增，在其對肺炎支原體的特異性基因P1的檢測中，檢測下限可以低至10fg，具有非常高的靈敏度。另外，本發明提供的擴增方法具有很高的擴增特異性。在對常見的致病菌、條件致病菌及非肺炎支原體DNA的檢測中，均為陰性擴增，只有肺炎支原體呈特異性擴增，說明所建立的方法具有極高的特異性，能準確地鑒定肺炎支原體，無假陽性及假陰性結果產生。

本申請是申請日為2019年03月19日、申請號為201910209767.8、發明名稱為《多交叉恒溫擴增結合納米生物傳感檢測肺炎支原體的方法》的分案申請。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，公開了一種用于多交叉恒溫擴增結合納米生物傳感檢測肺炎支原體的引物組合和檢測肺炎支原體的方法。

背景技術

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)是人類呼吸道感染性疾病最常見的病原體之一，也是社區獲得性肺炎的主要病原體。在MP流行時期，由MP引起的社區獲得性肺炎在一般人群中約占20％-40％，而在封閉人群中可高達70％。MP感染可發生在各年齡段人群中，其中以學齡期兒童和青少年最為常見。MP感染引起的臨床癥狀多種多樣，輕者臨床表現與其他病原體感染引起的非特異性癥狀類似，如發熱、咳嗽、流涕等；重者可表現為重癥肺炎、呼吸衰竭等嚴重的呼吸系統疾病，甚至累及中樞系統、消化系統等。β-內酰胺類藥物作用于細胞壁，是呼吸道感染性疾病經驗性治療常選藥物，然而MP缺乏細胞壁，因此對作用于細胞壁的藥物天然耐藥。因此研發一個可用于診斷MP感染的簡單、快速、敏感性和特異性較高的MP檢測方法，對合理應用抗生素，有效治療MP至關重要。

目前用于MP感染診斷的MP檢測方法主要有：培養法、血清學檢測、分子生物學檢測。培養法是MP檢測的金標準，但是該種方法并不推薦用于MP 檢測，因為MP對生長條件要求苛刻、實驗室要求比較高、技術人員要求比較嚴格，并且MP生長緩慢，需2～4周才可以獲得培養結果。血清學檢測因其便利性、敏感性和特異性較好而廣泛用于實驗室檢測，但是血清學檢測受采樣時間，患者年齡、機體免疫狀態等因素的影響，同時血清學檢測結果的可靠性依賴急性期和恢復期雙份血清的獲取，由于恢復期血清難以獲取，因此限制了血清學檢測在臨床上的應用。隨著分子生物學技術的發展，以PCR 為基礎的核酸檢測技術開始廣泛用于MP檢測，其中Real-time PCR是目前臨床常用的MP快速檢測技術。但是該檢測方法依賴精密復雜的儀器，昂貴的探針，對實驗室條件和技術人員要求比較高，因此該檢測方法不適用于基層醫院。

近年來為了克服PCR檢測的不足，以恒溫擴增技術為基礎的核酸檢測技術迅速發展。恒溫擴增技術較PCR技術而言，不依賴于熱循環擴增設備，僅需要水浴鍋或簡單的PCR儀即可，并且恒溫擴增核酸檢測技術具有特異性和敏感性高、操作簡單、反應迅速的優點，因此恒溫擴增技術可廣泛用于各醫療機構。迄今為止，恒溫擴增技術已有10余種，目前應用較為廣泛的有滾環擴增(RCA)、鏈置換擴增(SDA)、解旋酶依賴的恒溫擴增(HDA)、環介導恒溫擴增(LAMP)、交叉擴增(CPA)等。然而，這些恒溫擴增技術依賴多種酶同時工作，試劑昂貴、操作復雜，在欠發達地區及快速檢測技術領域不適合推廣應用。為克服PCR技術和現有的恒溫擴增技術的劣勢，實現簡單、快速、靈敏、特異的核酸檢測，發明人近期新建了一種核酸擴增技術，命名為多交叉置換擴增(Multiple Cross Displacement Amplication,MCDA)，相關內容公開于CN104946744A，該專利文件作為現有技術文件構成本申請說明書的一個部分。