[發明專利]一種基于限域效應實現重組大腸桿菌控溫發酵高效合成D-阿洛酮糖的方法

在審

• 申請號: 202211295091.7
• 申請日: 2022-10-21
• 公開（公告）號: CN115976134A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 范立海;張亞星;郭強;鄭靈潔;鄭輝東
• 申請（專利權）人: 福州大學;清源創新實驗室
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12N1/21;C12N15/61;C12N15/54;C12N15/31;C12N1/36;C12R1/19
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 彭琴;蔡學俊

本發明提供了一種基于限域效應實現重組大腸桿菌控溫發酵高效合成D?阿洛酮糖的方法。利用大腸桿菌JM109(DE3)為宿主，通過敲除基因fruA,mak,manXYZ，galE和經轉錄組測序篩選獲得的D?阿洛酮糖內轉運蛋白關鍵基因fryA，同時引入外源D?阿洛酮糖3?差向異構酶基因dpe以及表達第34位堿基g突變為t的果糖非特異性轉運蛋白基因ptsG?F構建重組菌株JM109(DE3)(DPE,PtsG?F,ΔFruA,ΔMak,ΔManXYZ,ΔGalE，ΔFryA)。對該重組菌株進行高低溫轉換的控溫發酵和補料分批發酵實現D?阿洛酮糖的高效合成。

技術領域

本發明屬于生物化工領域，具體涉及利用馴化培養大腸桿菌的方法通過轉錄組分析得到上調的膜蛋白基因，隨后利用基因工程技術改造大腸桿菌，得到空間限域的重組菌株，通過溫控設計能夠很大程度提高D-果糖合成D-阿洛酮糖的轉化率。

背景技術

D-阿洛酮糖?(D-Allulose)?作為D-果糖的C-3差向異構體，是自然界中天然存在的稀有單糖，并且具有極低卡路里和較高甜度，同時有著特殊的理化性質與生理功能，例如抗炎、抗氧化、降血糖；所以D-阿洛酮糖不僅是一種理想的代糖產品，且在保健品行業具有較大市場潛力，故D-阿洛酮糖的合成一直備受關注。

現階段生物酶催化法和微生物發酵法在D-阿洛酮糖的合成方法中條件最為溫和，能耗較低且對環境無毒，故生物法合成D-阿洛酮糖備受關注。生物酶催化法合成D-阿洛酮糖的弊端在于生物酶的成本較高，穩定性較差且固定化較為繁瑣，相較之下，微生物發酵法不僅規避了酶不穩定且成本較高的問題，同時具備生物法合成D-阿洛酮糖的優勢：原料綠色、過程綠色和產品綠色。目前有兩種微生物發酵合成D-阿洛酮糖的方法：可逆異構化反應和磷酸化、脫磷酸化不可逆反應。可逆異構化反應轉化率偏低，產率較高，磷酸化和脫磷酸化反應屬于不可逆反應，轉化率和產率較低。可逆異構化反應可以基于空間限域效應，通過基因工程技術構建重組大腸桿菌穩定產出D-阿洛酮糖，提高其轉化率，使其高效合成D-阿洛酮糖。

發明內容

本發明旨在針對上述問題，提供一種基于限域效應實現重組大腸桿菌控溫發酵高效合成D-阿洛酮糖的方法。通過敲除大腸桿菌JM109?(DE3)的基因 galE并引入外源基因 rpi，將重組大腸桿菌在以D-阿洛酮糖為碳源的LB培養基中進行馴化培養，對該菌株進行轉錄組測序分析，確定大腸桿菌中D-阿洛酮糖的內轉運蛋白關鍵基因 fryA，基于限域效應，將 fruA,? mak, ?manXYZ,? galE連同 fryA敲除后，表達 dpe和 ptsG-F，通過溫度的選擇與調控，提高D-果糖合成D-阿洛酮糖的產量。

為了實現上述目的，本發明的實施方案如下：