[發明專利]一種基于限域效應實現重組大腸桿菌控溫發酵高效合成D-阿洛酮糖的方法

在審

• 申請號: 202211295091.7
• 申請日: 2022-10-21
• 公開（公告）號: CN115976134A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 范立海;張亞星;郭強;鄭靈潔;鄭輝東
• 申請（專利權）人: 福州大學;清源創新實驗室
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12N1/21;C12N15/61;C12N15/54;C12N15/31;C12N1/36;C12R1/19
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 彭琴;蔡學俊

1.一種基于限域效應實現重組大腸桿菌控溫發酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：首先以大腸桿菌JM109?(DE3)為宿主，敲除UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因galE，并引入核糖-5-磷酸異構酶基因rpi，構建重組菌株JM109?(DE3)?(RPI,?ΔGalE)，使用含D-阿洛酮糖的LB培養基對重組菌株JM109?(DE3)?(RPI,?ΔGalE)進行馴化培養，以提高重組菌株中D-阿洛酮糖內轉運蛋白的表達量，之后進行轉錄組測序分析，篩選出大腸桿菌的D-阿洛酮糖內轉運蛋白關鍵基因fryA；隨后在大腸桿菌JM109?(DE3)中敲除果糖特異性PTS多磷酸化轉運蛋白基因fruA，果糖激酶基因mak，甘露糖特異性PTS轉運蛋白基因manXYZ，UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因galE，以及D-阿洛酮糖內轉運蛋白關鍵基因fryA，共5個基因，并引入D-阿洛酮糖?3-差向異構酶基因dpe和果糖非特異性轉運蛋白基因ptsG-F，構建重組菌株JM109?(DE3)?(DPE,?PtsG-F,?ΔFruA,?ΔMak,?ΔManXYZ,?ΔGalE，ΔFryA)，該重組菌株通過控溫發酵，最終實現D-阿洛酮糖的高效合成。

2.根據權利要求1所述的基于限域效應實現重組大腸桿菌控溫發酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，包括以下步驟：

（1）以大腸桿菌JM109?(DE3)為宿主，敲除UDP-葡萄糖-4-差向異構酶基因galE，并引入核糖-5-磷酸異構酶基因rpi，構建重組菌株JM109?(DE3)?(RPI,?ΔGalE)；通過在LB培養基中添加D-阿洛酮糖對重組菌株JM109?(DE3)?(RPI,

ΔGalE)進行馴化培養，后經轉錄組測序分析，篩選出D-阿洛酮糖的內轉運蛋白關鍵基因fryA；

（2）將大腸桿菌JM109?(DE3)中的fruA,?mak,?manXYZ,?galE和fryA基因敲除，并表達dpe和ptsG-F基因，得到重組菌株JM109?(DE3)?(DPE,?PtsG-F,?ΔFruA,?ΔMak,?ΔManXYZ,?ΔGalE，ΔFryA)；

（3）在步驟（2）得到的重組菌株JM109?(DE3)?(DPE,?PtsG-F,?ΔFruA,?ΔMak,?ΔManXYZ,?ΔGalE,?ΔFryA)的基礎上，根據外源基因dpe的體外酶催化實驗，確定D-果糖合成D-阿洛酮糖轉化率最高的溫度，同時結合大腸桿菌耐熱性實驗，獲得重組大腸桿菌JM109(DE3)?(DPE,?PtsG-F,?ΔFruA,?ΔMak,?ΔManXYZ,?ΔGalE，ΔFryA)由高溫狀態49?℃切換為低溫狀態30?℃，細胞正常生長；

（4）重組菌株JM109?(DE3)?(DPE,?PtsG-F,?ΔFruA,?ΔMak,?ΔManXYZ,?ΔGalE，ΔFryA)通過搖瓶溫控及發酵罐分批補料發酵，實現發酵法高轉化率及高得率合成D-阿洛酮糖。

3.根據權利要求2所述的基于限域效應實現重組大腸桿菌控溫發酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：步驟（1）中馴化培養重組大腸桿菌JM109?(DE3)?(RPI,?ΔGalE)的條件是：，重組大腸桿菌在含有4?g/L?D-阿洛酮糖的100mL?LB培養基中，加入終濃度0.2mMIPTG后，在30?℃，?220?rpm的條件下誘導培養24?h。

4.根據權利要求2所述的基于限域效應實現重組大腸桿菌控溫發酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，步驟（1）所述的D-阿洛酮糖蛋白關鍵基因fryA的基因序列如SEQIDNO.1所示。