[發明專利]pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202211295076.2
• 申請日: 2022-10-21
• 公開（公告）號: CN115851836A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 史明;任浩然;李盈;馮佳;馬慧慧
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/36;C12N15/85;C12N15/66;A01K67/027
• 代理公司: 哈爾濱華夏松花江知識產權代理有限公司 23213
• 代理人: 侯靜

pAAV?HBVp/HBV1.2重組載體及其構建方法和應用，涉及一種重組載體及其構建方法和應用。是要解決現有小鼠模型中小鼠體內HBV難以形成持續感染的問題。該重組載體包括腺相關病毒載體pAAV?CMV和HBV啟動子。構建方法：一、使用限制性內切酶將質粒HBV1.2及腺相關病毒載體pAAV?MCS進行雙酶切，連接轉化后，得pAAV?CMV/HBV1.2重組體；二、重組體雙酶切，去除CMV啟動子，將HBV啟動子區域進行PCR擴增、連接，得到pAAV?HBVp/HBV1.2重組載體。本發明重組載體用于構建小鼠HBV持續感染模型，能夠長時間維持小鼠血清中高HBV DNA拷貝數，有助于乙肝病毒持續感染中宿主對HBV免疫應答的研究。

技術領域

本發明涉及動物模型構建領域，尤其涉及一種重組載體及其構建方法和應用。

背景技術

乙型肝炎病毒(Hepatitis B，HBV)是引起乙型肝炎(簡稱乙肝)的病原體，其屬于嗜肝DNA病毒屬，一直以來都是世界范圍內持續存在的健康問題。HBV主要感染人的肝細胞，其感染可顯著提高肝硬化和肝癌的發病率。盡管在研究和開發方面取得了巨大的技術進步，但目前只有通常在早期接種的HBV疫苗可用作預防HBV感染的措施。

針對HBV感染者，目前臨床上主要有干擾素α和核苷類似物，或針對其表面抗原的多克隆抗體。這些藥物雖然可以有效抑制HBV復制并減緩疾病進程，但不能達到徹底治愈。由于缺少簡便易操作的動物感染模型，HBV相關機制研究和藥物研發受到了很大的阻礙。

當前研究中采用小鼠尾靜脈高壓注射模型模擬人的HBV感染，但由于人體和小鼠模型之間存在的HBV清除差異，導致HBV在小鼠體內很難形成持續的感染，極大地制約了HBV免疫應答機制研究與藥物研發的進程。

發明內容

本發明是要解決現有小鼠模型中小鼠體內HBV難以形成持續感染的問題，提供一種pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體及其在構建小鼠HBV持續感染模型中的應用。

本發明的pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體包括腺相關病毒載體pAAV-CMV和HBV啟動子，所述HBV啟動子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本發明還提供pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體的構建方法為：

一、使用限制性內切酶ClaⅠ和SalⅠ將質粒HBV1.2及腺相關病毒載體pAAV-MCS進行雙酶切，連接轉化后，即得到pAAV-CMV/HBV1.2重組體；

二、將構建好的pAAV-CMV/HBV1.2重組體通過MluⅠ和SacⅠ雙酶切后，切除CMV啟動子，并使用引物HBV promoter-MluI-F和HBV promoter-SacI-R將HBV啟動子區域進行PCR擴增，與切除CMV啟動子后的線性化pAAV-CMV/HBV1.2重組體進行連接，最終得到pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體。

進一步的，步驟一所述質粒HBV1.2為質粒pBB4.5-HBV1.2。

進一步的，步驟二所述引物HBV promoter-MluI-F為5’-CGACGCGTTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAG-3’，引物HBV promoter-SacI-R為5’-CGAGCTCCTGCAATACAGAGCTGAGGCGG-3’。

進一步的，步驟二所述PCR擴增體系為：

進一步的，步驟二所述PCR擴增反應條件為：95℃預變性10min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共50個循環；72℃延伸5min；4℃保存。

本發明還提供所述pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體在構建小鼠HBV持續感染模型中的應用。

所述小鼠HBV持續感染模型的構建方法為：