[發明專利]pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202211295076.2
• 申請日: 2022-10-21
• 公開（公告）號: CN115851836A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 史明;任浩然;李盈;馮佳;馬慧慧
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/36;C12N15/85;C12N15/66;A01K67/027
• 代理公司: 哈爾濱華夏松花江知識產權代理有限公司 23213
• 代理人: 侯靜

1.pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體，其特征在于該重組載體包括腺相關病毒載體pAAV-CMV和HBV啟動子，所述HBV啟動子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.如權利要求1所述pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體的構建方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

一、使用限制性內切酶ClaⅠ和SalⅠ將質粒HBV1.2及腺相關病毒載體pAAV-MCS進行雙酶切，連接轉化后，即得到pAAV-CMV/HBV1.2重組體；

二、將構建好的pAAV-CMV/HBV1.2重組體通過MluⅠ和SacⅠ雙酶切后，切除CMV啟動子，并使用引物HBV promoter-MluI-F和HBV promoter-SacI-R將HBV啟動子區域進行PCR擴增，與切除CMV啟動子后的線性化pAAV-CMV/HBV1.2重組體進行連接，最終得到pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體。

3.根據權利要求2所述的pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體的構建方法，其特征在于步驟一所述質粒HBV1.2為質粒pBB4.5-HBV1.2。

4.根據權利要求2或3所述的pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體的構建方法，其特征在于步驟二所述引物HBV promoter-MluI-F為5’-CGACGCGTTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAG-3’，引物HBVpromoter-SacI-R為5’-CGAGCTCCTGCAATACAGAGCTGAGGCGG-3’。

5.根據權利要求4所述的pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體的構建方法，其特征在于步驟二所述PCR擴增體系為：

。

6.根據權利要求5所述的pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體的構建方法，其特征在于步驟二所述PCR擴增反應條件為：95℃預變性10min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共50個循環；72℃延伸5min；4℃保存。

7.如權利要求1所述pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體在構建小鼠HBV持續感染模型中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述小鼠HBV持續感染模型的構建方法為：

取生長至4-6周的小鼠，將含有pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體的生理鹽水，采用尾靜脈高壓注射到每只小鼠體內。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述尾靜脈高壓注射使用可視尾靜脈注射固定器進行操作。

10.根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于每只小鼠注射的生理鹽水體積與小鼠體重的比為8mL:100g，其中含有pAAV-HBVp/HBV1.2重組載體10-20μg。