[發明專利]胎盤間充質干細胞制備的外泌體及其用途

在審

• 申請號: 202211289694.6
• 申請日: 2022-10-20
• 公開（公告）號: CN115558638A
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 魏卿;肖海蓉;劉慶喜;裴麗環
• 申請（專利權）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P29/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.使用胎盤間充質干細胞分離提取的外泌體，其具有50～200nm的平均粒徑，并且其表達了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81，該外泌體膜蛋白CD9的陽性表達率大于70％，膜蛋白CD81的陽性表達率大于80％。

2.根據權利要求1的外泌體，其具有75～150nm的平均粒徑，并且膜蛋白CD9的陽性表達率大于75％，膜蛋白CD81的陽性表達率大于85％。

3.根據權利要求1的外泌體，其是使用胎盤間充質干細胞通過包括如下步驟的方法制備得到的：

(1)將間充質干細胞接種至培養瓶中，添加MSC完全培養基，置37℃、5％CO₂培養箱中培養使細胞貼壁，再向培養液中添加IL-1β至濃度8～12ng/mL，繼續培養；

(2)吸棄培養基，更換為新鮮的MSC完全培養基，使細胞繼續于37℃、5％CO₂培養箱中培養直至細胞融合度≥80％；

(3)吸棄培養基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培養基，再置于37℃、2％O₂、5％CO₂培養箱中培養42～56小時；

(4)吸取細胞上清液置離心管中，進行如下離心處理：

以250～350g、4℃離心8～12分鐘，吸取上清液至另一離心管中；

以1500～2500g、4℃離心18～25分鐘，吸取上清液至另一離心管中；

以8000～12000g、4℃離心25～35分鐘，上清液用0.22μm濾膜過濾后置于另一離心管中；

以80000～120000g、4℃離心75～120分鐘，棄上清；

(5)向離心管中添加無菌PBS使外泌體沉淀重懸，以80000～120000g、4℃離心75～120分鐘，棄上清液，加無菌PBS使外泌體重懸，得到呈懸液形式的外泌體。

4.根據權利要求3的外泌體，步驟(1)中，

間充質干細胞是P2～P8代的細胞，例如是P3～P6代的細胞；

培養瓶中以(0.5～5)×10^4個細胞/cm^2的密度添加細胞，例如以(0.5～2)×10^4個細胞/cm^2的密度添加細胞；

使用T75培養瓶，每瓶接種(2～10)×10^5個細胞例如7.5×10^5個細胞，添加培養基10～20ml；

培養20～30小時例如培養24小時使細胞貼壁；

添加IL-1β后繼續培養20～30小時例如培養24小時；

在添加IL-1β的同時還向培養液中添加酒石酸鈉、賴氨酸，二者的濃度分別為0.15～0.2mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的濃度分別為0.15mg/mL、2.2mg/mL。

5.根據權利要求3的外泌體，步驟(3)中，在37℃、2％O₂、5％CO₂培養箱中培養48小時。

6.根據權利要求3的外泌體，步驟(4)中，

首先以250g、4℃離心12分鐘，接著以2500g、4℃離心18分鐘，接著以8000g、4℃離心35分鐘，上清液用0.22μm濾膜過濾后以120000g、4℃離心75分鐘；

首先以350g、4℃離心8分鐘，接著以1500g、4℃離心25分鐘，接著以12000g、4℃離心25分鐘，上清液用0.22μm濾膜過濾后以80000g、4℃離心120分鐘；

首先以300g、4℃離心10分鐘，接著以2000g、4℃離心20分鐘，接著以10000g、4℃離心30分鐘，上清液用0.22μm濾膜過濾后以100000g、4℃離心90分鐘。

7.根據權利要求3的外泌體，步驟(5)中，

以100000g、4℃離心90分鐘，或者以80000g、4℃離心120分鐘，或者以120000g、4℃離心75分鐘；

所得的外泌體懸液置-80℃保存；

以步驟(1)之1.5×10^6個細胞獲得的外泌體用0.5～5ml無菌PBS重懸，例如用0.5～2ml無菌PBS重懸，例如用1ml無菌PBS重懸。