[發(fā)明專利]檢測狼瘡性腎炎標志物的試劑及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211284174.6
• 申請日: 2022-10-14
• 公開（公告）號: CN116400075A
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發(fā)明（設計）人: 陳崴;蔣小云;彭穗;周怡;唐睿晗
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第一醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/58;C07K16/28
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中

1.檢測狼瘡性腎炎標志物的試劑，其特征在于，所述標志物為DC3細胞，所述試劑包括Anti-CD163抗體與Anti-CD11c抗體、Anti-CD1c抗體中的至少一種。

2.根據(jù)權利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑包括Anti-CD11c抗體和Anti-CD163抗體。

3.一種試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的試劑。

4.一種多重免疫組化檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

一抗：Anti-CD11c抗體、Anti-CD163抗體；HRP二抗TSA熒光染料；DAPI染色液。

5.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述TSA熒光染料包括單色熒光染料-520、單色熒光染料-650。

6.多重免疫組化法檢測腎臟中DC3細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）樣品準備：腎穿刺活檢石蠟組織切片脫蠟、復水；

抗原修復；

封閉抗體；

染色：用1X?PBS清洗切片，加入Anti-CD11c抗體，37℃孵育，清洗后加入HRP二抗，室溫孵育，再次清洗后加入TSA熒光染料，室溫孵育；

Anti-CD163抗體染色：重復步驟（2）、（3）、（4）；

DAPI染色、封片、掃片；

通過分析系統(tǒng)檢測并統(tǒng)計腎臟病理切片完整視野中DC3（CD11c+CD163+）細胞的數(shù)量。

7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）具體為：將切片浸入修復液，再放入微波爐中加熱至沸騰，沸騰后繼續(xù)保持95℃10-15分鐘，冷卻；步驟（4）中一抗采用1%山羊血清稀釋，Anti-CD11c抗體稀釋比例為1:200；步驟（5）中Anti-CD163抗體稀釋比例為1:200。

8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述修復液為檸檬酸鹽修復液。

9.根據(jù)權利要求1或2所述的試劑，其特征在于，所述抗體的制備步驟為：

S1：雜交瘤細胞的制備：采用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞；

S2：細胞融合：收集小鼠骨髓瘤細胞和脾細胞并進行前處理，處理后按比例添加，進行細胞融合；

S3：雜交瘤細胞的培養(yǎng)和篩選：將融合細胞轉移至篩選培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天后進行雜交瘤抗體篩選；

S4：單克隆抗體的大量制備：將制備好的雜交瘤細胞接種在小鼠腹腔中，等待數(shù)周，見小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

10.根據(jù)權利要求9所述的試劑，其特征在于，所述抗CD163抗體制備時使用的目的抗原氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，和/或所述抗CD11c抗體制備時使用的目的抗原氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，和/或所述抗CD1c抗體制備時使用的目的抗原氨基酸序列如SEQ?IDNo.3所示。

11.根據(jù)權利要求9所述的試劑，其特征在于，步驟S1中具體包括：

（1）選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，目的抗原與弗氏完全佐劑按比例混合，給小鼠進行皮下注射，共接種2-4次，每次間隔2-4周；

（2）接種2-4次后采血進行抗體滴度ELISA檢測，通過ELISA檢測確定小鼠血中抗體陽性后，小鼠即可用于后續(xù)的細胞融合和雜交瘤細胞制備。

12.根據(jù)權利要求9所述的試劑，其特征在于，步驟S2中具體包括：按照1:5比例將前處理后的小鼠骨髓瘤細胞和脾細胞采用聚乙二醇介導進行細胞融合。

13.根據(jù)權利要求9所述的試劑，其特征在于，步驟S3中具體包括：將融合細胞轉移至HT篩選培養(yǎng)基中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7~10天后進行雜交瘤抗體篩選。