[發(fā)明專利]一種抗菌物質(zhì)吉類菌素的制備及重組表達方法和醫(yī)用用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211282508.6
• 申請日: 2022-10-19
• 公開（公告）號: CN115947802A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設計）人: 楊勇軍;馬軻;陳巍
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12P21/02;C07K1/30;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/20;C07K1/22;C07K1/36;A61K38/16;A61P31/04;A23L3/3526;A23C3/08;A23K20/147
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

本發(fā)明公開了一種抗菌物質(zhì)吉類菌素的制備及重組表達方法和醫(yī)用用途，從吉林類芽孢桿菌培養(yǎng)上清中純化得到一種新型細菌素類抗菌物質(zhì)??吉類菌素，確定了其氨基酸序列特征和編碼基因，應用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得了具有抗菌活性的重組吉類菌素。吉類菌素具有強抗菌活性，較寬抗菌譜，優(yōu)良穩(wěn)定性，極低細胞毒性和溶血活性，并且不產(chǎn)生耐藥性。牛奶保鮮應用分析顯示，吉類菌素能高效殺滅牛奶中的屎腸球菌，延長牛奶保存期，且不影響牛奶品質(zhì)。動物抗感染實驗表明，吉類菌素對小鼠耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染具有顯著治療作用。

技術領域

本發(fā)明公開一種吉類菌素，為一種新型抗菌物質(zhì)，尤其是提供了吉類菌素的制備及重組表達方法，同時還提供了吉類菌素在制備抗細菌感染藥物中的醫(yī)用用途，屬于生物醫(yī)藥技術領域。

背景技術

耐藥細菌對動物養(yǎng)殖和人類健康構(gòu)成了巨大威脅，開發(fā)能有效抵抗耐藥細菌的新型抗菌物質(zhì)顯然已成為迫切需要。然而正在研發(fā)的化學合成抗生素很少，而且其中大多數(shù)是當前抗生素的衍生物。因此，不斷尋求新型抗菌藥物已成為人們的共識。畜禽養(yǎng)殖中抗生素類藥物作為飼料添加劑和治療藥物廣為使用，但抗生素的長期不合理使用，帶來嚴重的安全性問題如藥物殘留和病原菌耐藥性擴散。故而尋找高效、廣譜、無殘留、無耐藥性、低副作用的抗生素替代品，是近些年來人們一直努力的目標。抗菌蛋白或多肽具有獨特的結(jié)構(gòu)序列、作用機制和高效的殺菌效果，同時和傳統(tǒng)的抗生素基本不會產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象，因而是抗生素的最佳替代品。

細菌素是微生物在進化過程中產(chǎn)生的一類防御分子，是由特定細菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽，能抑制其他微生物定植和生長。細菌素類抗菌蛋白或多肽體現(xiàn)出對耐藥致病菌殺菌活性強，而對于益生菌殺菌活性弱的特征。細菌素的這種選擇性作用，使其在糾正腸道菌群失調(diào)和拮抗致病菌方面具有良好優(yōu)勢。細菌素不易誘導致病菌耐藥性產(chǎn)生，對真核細胞毒性低，易于降解和殘留少。細菌素類抗菌蛋白或多肽因其獨特的結(jié)構(gòu)序列、作用機制和高效殺菌效果，不易產(chǎn)生耐藥性，同時和傳統(tǒng)抗生素基本不會產(chǎn)生交叉耐藥，有著廣闊的應用前景，成為新一代的抗生素替代品而備受青睞。乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素（也稱乳鏈菌肽、Nisin）是發(fā)現(xiàn)早、研究清楚的細菌素，自1950年以來已作為食品防腐劑和獸藥得以廣泛應用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開的一種吉類菌素，為一種新型含SIMPL結(jié)構(gòu)域蛋白，屬于細菌素樣抗菌物質(zhì)，由吉林類芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，它顯示可以拮抗多種病原菌的生長，具有抗感染的醫(yī)用用途。

本發(fā)明所述的一種吉類菌素，是由吉林類芽孢桿菌（中國專利CN?112574929?A中公開了從雞腸道分離獲得的芽孢桿菌屬菌種）產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ?IDNO.1所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明還提供的一種吉類菌素的純化制備方法，包括如下步驟：

1、發(fā)酵上清制備：將-80℃凍存的吉林類芽孢桿菌在TSB平板劃線，37℃培養(yǎng)至形成單菌落，然后挑取單菌落至3ml?TSB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖晃培養(yǎng)12h，然后以1%比例轉(zhuǎn)接至5L?TSB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖晃培養(yǎng)10?h，10000rpm離心10min，0.22μm濾器過濾得發(fā)酵上清；

2、粗提液制備：將發(fā)酵上清以70%飽和度的硫酸銨進行4℃沉淀過夜，之后10000rpm離心20min，收集沉淀，以蒸餾水復溶之后用1000?Da的透析袋進行透析，直至硫酸銨被完全去除，然后冷凍干燥獲得粗提物；

3、純化：將粗提物應用凝膠過濾層析和HPLC進行純化。將粗提物通過Sephadex?G-75凝膠過濾層析柱，流速1ml/min，以0.22μm濾膜過濾的無菌蒸餾水進行洗脫，以280nm為檢測波長，收集各洗脫峰，測定抗菌活性確定目標峰；將目標峰利用C18液相色譜柱經(jīng)HPLC進行進一步純化，流動相為A，蒸餾水；B：乙腈，0-20min線性洗脫，多次重復進樣后，將抗菌目標峰合并，冷凍干燥獲得吉類菌素。

本發(fā)明進一步提供了吉類菌素的重組表達方法，包括以下步驟：