[發明專利]一種抗菌物質吉類菌素的制備及重組表達方法和醫用用途

在審

• 申請號: 202211282508.6
• 申請日: 2022-10-19
• 公開（公告）號: CN115947802A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 楊勇軍;馬軻;陳巍
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12P21/02;C07K1/30;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/20;C07K1/22;C07K1/36;A61K38/16;A61P31/04;A23L3/3526;A23C3/08;A23K20/147
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種吉類菌素，其特征在于：是由吉林類芽孢桿菌產生的抗菌物質，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.權利要求1所述的吉類菌素的制備方法，包括如下步驟：

（1）發酵上清制備：

將-80℃凍存的吉林類芽孢桿菌在TSB平板劃線，37℃培養至形成單菌落，然后挑取單菌落至3ml?TSB液體培養基中，37℃、200rpm搖晃培養12h，然后以1%比例轉接至5L?TSB液體培養基中，37℃、200rpm搖晃培養10?h，10000rpm離心10min，0.22μm濾器過濾得發酵上清；

（2）粗提液制備：

將發酵上清以70%飽和度的硫酸銨進行4℃沉淀過夜，之后10000rpm離心20min，收集沉淀，以蒸餾水復溶之后用1000?Da的透析袋進行透析，直至硫酸銨被完全去除，然后冷凍干燥獲得粗提物；

（3）純化：

將粗提物應用凝膠過濾層析和HPLC進行純化；將粗提物通過Sephadex?G-75凝膠過濾層析柱，流速1ml/min，以0.22μm濾膜過濾的無菌蒸餾水進行洗脫，以280nm為檢測波長，收集各洗脫峰，測定抗菌活性確定目標峰；進一步將目標峰利用C18液相色譜柱經HPLC進行純化，流動相為A，蒸餾水；B：乙腈，0-20min線性洗脫，多次重復進樣后，將檢測具有抗菌作用的活性峰合并，冷凍干燥獲得吉類菌素。

3.權利要求1所述的吉類菌素的一種重組表達方法，其特征在于步驟為：

1）基因片段擴增：

設計相應引物，擴增吉類菌素基因片段，經酶切和連接，構建表達載體pET28a，并且通過轉化構建表達菌株大腸桿菌BL21（DE3）；

引物如下：

JC-1?F:?CTGGGATCCAATGTAGTTAATGTGGTTGGC；

R:?CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；

JC-2?F:?CTGGGATCCATGAAAATTTGGGTCAAATC；

R:?CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACT；

JC-25?F:?CTGGGATCCGGAGATCTGTTAAGCGGAGCT；

R:?CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；

JC-37?F:?CTGGGATCCGATGAAGCCGTGCAGCGCAAT；

R:?CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；

2）誘導表達：

16℃，180?rpm，LB培養基中培養，應用1?mM咪唑誘導24?h；

3）純化：

應用鎳柱進行親和層析純化，分別用20?mM、100mM、500?mM咪唑進行洗脫，收集500?mM咪唑洗脫部分，應用超濾除去咪唑等雜質，之后冷凍干燥純化得到重組表達吉類菌素。

4.權利要求1所述的吉類菌素在制備治療金黃色葡萄球菌感染藥物的用途。

5.權利要求1所述的吉類菌素在制備治療小鼠和大蠟螟幼蟲金黃色葡萄球菌感染藥物中的用途。

6.權利要求1所述的吉類菌素在食品保鮮劑中的用途。

7.權利要求1所述的吉類菌素在制備牛奶保鮮劑中的應用。