[發明專利]基于DNA walker及支鏈雜交鏈式反應檢測乳腺癌循環腫瘤核酸的探針組及方法

在審

• 申請號: 202211275853.7
• 申請日: 2022-10-18
• 公開（公告）號: CN116144770A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 張何;楊梅;馬文杰;劉瓊;傅裕;傅昕
• 申請（專利權）人: 湖南工程學院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/682;C12Q1/6825;C12N15/11;C12N15/54
• 代理公司: 長沙伊柏專利代理事務所(普通合伙) 43265
• 代理人: 丁敏

本發明提供了一種基于DNA?walker及支鏈雜交鏈式反應檢測乳腺癌循環腫瘤核酸的探針組及方法，包括熵驅動復合鏈S、NH探針、N1探針、N2探針、N3探針和輔助鏈F探針，熵驅動復合鏈S由C1、C2和C3探針雜交形成，熵驅動復合鏈S與NH探針結合于微球表面形成功能化微球，C1探針為DNA?walker，C1含有8?17脫氧核酶催化活性中心，探針組在Znsupgt;2+/supgt;催化下通過多重信號放大實現對乳腺癌靶標基因PIK3CA的高靈敏檢測。該探針組利用恒溫無酶熵驅動鏈置換反應激活8?17脫氧核酶，利用此雙驅動使三維DNA?walker隨著軌道分子切割出多條引發序列，引發支鏈雜交鏈式反應，加入Hemin形成多個Hemin嵌入式G?四鏈體DNA酶，催化過氧化氫和ABTS反應并在420nm有特征吸收峰，實現對乳腺癌靶標基因PIK3CA高靈敏度和特異性檢測。

技術領域

本發明涉及生物分析檢測技術領域，具體涉及一種基于DNA?walker及支鏈雜交鏈式反應檢測乳腺癌循環腫瘤核酸的探針組及方法。

背景技術

乳腺癌是目前全球女性中最常見的惡性腫瘤，其發病率已躍居我國女性惡性腫瘤的首位并呈現明顯上升趨勢，嚴重影響女性身心健康甚至危及生命，乳腺癌的防治形勢嚴峻。當下傳統的乳腺癌診斷技術主要分為兩種：影像學檢查(主要包括乳腺鉬靶X線檢查、乳腺超聲檢查、CT、MRI、PET-CT等)、乳腺組織活檢技術，其中，影像學檢測對人體有一定的傷害且主觀判斷性較高。乳腺組織穿刺活檢易發生出血、局部血腫、傷口感染等二次傷害，且存在組織學低估的可能。這些傳統方法均存在著儀器裝置笨重，掃描范圍和方式受到限制，價格昂貴，靈敏度低，不能準確追蹤腫瘤的動態變化、對于直徑小于1cm的早期乳腺癌檢出率較低等缺陷。

近年來隨著分子生物技術的發展，血液中發現一些具有特異性的腫瘤生物標志物，包括癌胚抗原、神經元特異性烯醇化酶、甲胎蛋白和前列腺抗原等蛋白標志物，利用這些蛋白標志物對乳腺癌進行免疫診斷，以免疫組織化學(IHC)檢測、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)為主，但免疫診斷測定結果與所用的抗體來源及親和力有很大的關系，使用不同來源親和力的單抗，對同一標本測到的結果可能不同，且敏感性相對較低，結果易受主觀因素影響，且這些蛋白標志物不僅存在于腫瘤病人血液中，也存在于正常個體內，因此血液中的蛋白標志物其診斷準確率不高。

腫瘤外周血循環核酸作為新一代的腫瘤標志物，已成為各國生命科學研究的重點之一。血液中循環腫瘤DNA(Circulating?tumor?DNA,ctDNA)分子是循環血液中游離于細胞外的部分被降解的機體內源性核酸，可用于腫瘤早期無創檢測。其中，PIK3CA基因編碼1A類磷酸肌苷-3-激酶p110催化亞基，在一些人類腫瘤，如乳腺癌中經常發生體細胞錯義突變，因此，PIK3CA基因對檢測乳腺癌至關重要，該基因保守序列可作為乳腺癌診斷的特異性生物標記物。當前分子生物學檢測主要為：原位雜交(In?situ?hybridization,ISH))檢測、實時熒光定量PCR(Real-time?Quantitative?PCR?Detecting?System，qPCR)、高通量測序、等溫核酸擴增技術、生物傳感器，這些方法均存在操作復雜、數據分析難度大、分析平臺要求高、成本高、單獨使用靈敏度低等問題。因此需要發展一種高靈敏、低成本、操作簡單且快速無創傷的檢測技術具有重要意義。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提出了一種基于DNA?walker及支鏈雜交鏈式反應檢測乳腺癌循環腫瘤核酸的探針組及方法，利用恒溫無酶熵驅動鏈置換反應激活8-17脫氧核酶，并利用此雙驅動使三維DNA?walker隨著軌道分子切割出多條引發序列，引發支鏈雜交鏈式反應，加入Hemin，形成多個Hemin嵌入式G-四鏈體DNA酶，催化過氧化氫和ABTS反應并在420nm有特征吸收峰，實現對于靶標基因的特異性檢測和信號放大，能夠高效、快速地完成對靶標DNA的檢測。