[發明專利]基于DNA walker及支鏈雜交鏈式反應檢測乳腺癌循環腫瘤核酸的探針組及方法

在審

• 申請號: 202211275853.7
• 申請日: 2022-10-18
• 公開（公告）號: CN116144770A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 張何;楊梅;馬文杰;劉瓊;傅裕;傅昕
• 申請（專利權）人: 湖南工程學院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/682;C12Q1/6825;C12N15/11;C12N15/54
• 代理公司: 長沙伊柏專利代理事務所(普通合伙) 43265
• 代理人: 丁敏

1.一種基于DNA?walker及支鏈雜交鏈式反應檢測乳腺癌循環腫瘤核酸的探針組，其特征在于，包括熵驅動復合鏈S、NH探針、N1探針、N2探針、N3探針和輔助鏈F探針，所述熵驅動復合鏈S由C1探針、C2探針和C3探針雜交形成，所述熵驅動復合鏈S與所述NH探針結合于微球表面形成功能化微球，所述C1探針為DNA?walker，所述C1探針含有8-17脫氧核酶催化活性中心，所述探針組在Zn²⁺催化下通過多重信號放大實現對乳腺癌靶標基因PIK3CA的高靈敏檢測；

其中，所述C1探針的基因序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述C2探針的基因序列如SEQ?IDNO.2所示，所述C3探針的基因序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述輔助鏈F探針的基因序列如SEQID?NO.4所示，所述N1探針的基因序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述N2探針的基因序列如SEQID?NO.6所示，所述N3探針的基因序列如SEQ?ID?NO.7所示，所述NH探針的基因序列如SEQID?NO.8所示。

2.根據權利要求1所述的探針組，其特征在于，所述乳腺癌靶標基因PIK3CA的基因序列如SEQ?ID?NO.9所示。

3.根據權利要求1所述的探針組，其特征在于，所述NH探針為發夾結構，含有引發鏈序列，所述引發鏈序列如SEQ?ID?NO.10所示。

4.一種如權利要求1～3任一項所述探針組用于非診療目的檢測乳腺癌循環腫瘤核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、探針序列預處理：將C1探針、C2探針、C3探針、NH探針、N1探針、N2探針、N3探針和輔助鏈F探針分別溶解于緩沖液中，將C1探針、C2探針、C3探針溶液混合孵育得到熵驅動復合鏈S；分別將NH探針、N1探針、N2探針、N3探針分別進行孵育形成亞穩態的發夾結構；

S2、構建功能化微球：將微球與步驟S1中的熵驅動復合鏈S和發夾結構的NH探針溶液混合孵育，得到功能化微球；

S3、熵驅動復合鏈S置換反應及DNA?walker切割反應：向待檢測溶液中加入功能化微球、輔助鏈F溶液和ZnCl₂溶液反應得到第一反應液；

S4、支鏈雜交鏈式反應形成G-四鏈體：將步驟S3中的第一反應液離心取上清液，加入N1探針、N2探針和N3探針溶液反應得到第二反應液；

S5、G–四鏈體–血紅素DNA酶的形成和比色分析：將步驟S4的第二反應液于黑暗條件下加入氯化血紅素，避光反應30～60min形成G–四鏈體–血紅素DNA?酶；再加入H₂O₂和ABTS，充分攪拌反應后得到第三反應液，將第三反液進行紫外分光光度計檢測，根據A_420nm處的最大吸收峰，根據標準曲線測算得到待檢測物中是否含有乳腺癌靶標基因PIK3CA及其濃度。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中C1探針、C2探針、C3探針溶液混合，在95℃孵育5min，然后以降溫速率為0.1℃/s緩慢降至室溫，且于室溫下孵育0.5h形成熵驅動復合鏈S。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中NH探針、N1探針、N2探針、N3探針溶液分別在95℃孵育5min，然后以降溫速率為0.1℃/s緩慢降至室溫，且于室溫下孵育0.5h形成亞穩態的發夾結構。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中孵育溫度為室溫，孵育時間為30～60min，孵育過程中間隔5min混勻。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中反應溫度為37℃，反應時間為1～2h。

9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟S4中反應溫度為25℃，反應時間為2～3h。

10.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述A_420nm處的最大吸收峰值為ΔA_420nm＝A_420nm－A₀，其中A_420nm為樣品的測量值，A₀為乳腺癌靶標PIK3CA基因濃度為0時的背景值。