[發(fā)明專利]一種大腸埃希菌快速核酸檢測的引物組合及檢測方法

在審

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• 申請日: 2022-10-18
• 公開（公告）號: CN116144808A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王保寧;劉人捷;符立發(fā);索朗斯珠;陳昱作
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué);西藏農(nóng)牧學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 四川北新律師事務(wù)所 51366
• 代理人: 李琳

本發(fā)明針對編碼大腸埃希氏菌共有的β?D?葡糖醛酸糖苷酶的uidA基因上的保守序列，按等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)的獨(dú)特特征，設(shè)計(jì)篩選出了5組特異性等溫?cái)U(kuò)增的引物組合，通過該引物組合建立了以該引物組合為核心的LAMP法檢測體系和檢測方法，可快速識別水、食品、環(huán)境等公共衛(wèi)生領(lǐng)域的大腸埃希氏菌，與現(xiàn)在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的常規(guī)培養(yǎng)方法比較，具有靈敏度高、可視化，檢測快速等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸埃希菌快速核酸檢測的引物組合及檢測方法。

背景技術(shù)

大腸埃希氏菌(Escherichia?coli,E.coli)是最常見的食源性病原微生物之一，也是臨床上最常見的導(dǎo)致腹瀉的病原體之一。大腸埃希氏菌原本是腸道中重要的正常菌群，在嬰兒出生后數(shù)小時(shí)內(nèi)就定植于嬰兒的胃腸道，這些共生的大腸埃希氏菌菌株很少引起疾病。但在人體免疫力下降或細(xì)菌侵入腸道外組織器官后，即可成為機(jī)會(huì)致病菌。此外，某些血清型的大腸埃希氏菌獲得了特定的毒力基因，具有廣泛的致病性，能引起腸胃炎。大腸埃希氏菌在隨人或動(dòng)物的糞便排出體外后能在環(huán)境中生存較長時(shí)間，并通過污染食品等導(dǎo)致人和其他動(dòng)物患病；即便不造成腹瀉，致瀉性大腸埃希氏菌的感染也可能使被感染的兒童發(fā)育遲緩。

大腸埃希氏菌是一類革蘭染色陰性的短棒狀兼性厭氧桿菌。多數(shù)菌株有周身鞭毛和菌毛，無芽孢。其生長速度快，培養(yǎng)要求低，常常被用作生物研究領(lǐng)域的工程菌，因此關(guān)于其各種特性的研究已十分詳實(shí)。長期以來，針對大腸埃希氏菌的檢測作為一種重要生物指標(biāo)被廣泛用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域。目前常用的方法主要有對活菌進(jìn)行檢測的培養(yǎng)法；以病原體特異性抗原為檢測靶點(diǎn)的免疫學(xué)檢查方法如酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked?immunosorbent?assay,ELISA)、免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence?technique,IFT)等；以病原體的核酸為檢測靶點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase?chain?reaction,PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time?quantitative?PCR,qPCR)、基因芯片(Gene?chip,GC)技術(shù)等。培養(yǎng)法檢出活菌是檢測各種病原菌的金標(biāo)準(zhǔn)，其檢測靈敏度極高、特異性強(qiáng)，并能進(jìn)行定量檢測；但缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、耗時(shí)良久。ELISA和IFT技術(shù)的特點(diǎn)比較相似，都有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快的優(yōu)點(diǎn)；但其缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、檢測成本較高。而在核酸檢測技術(shù)中：PCR是最經(jīng)典的核酸檢測技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)是檢測快速、準(zhǔn)確；缺點(diǎn)是需要另外進(jìn)行后續(xù)操作才能對結(jié)果進(jìn)行判讀，且儀器較昂貴。qPCR是對PCR的改進(jìn)，在PCR快速檢測的基礎(chǔ)上，對結(jié)果實(shí)現(xiàn)了一定程度上的實(shí)時(shí)定量和可視化；但qPCR所需要的儀器比PCR所用儀器更為昂貴。GC的自動(dòng)化程度高，可一次分析大量樣品，檢測快速、準(zhǔn)確；但成本很高。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明提供一種大腸埃希菌快速核酸檢測的引物組合及檢測方法,由于大腸埃希菌菌株具有β-D-葡糖醛酸糖苷酶(β-D-glucuronidase,GUS)活性，在本發(fā)明中，針對編碼大腸埃希氏菌β-D-葡糖醛酸糖苷酶的uidA基因上的保守序列設(shè)計(jì)了5組環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP)引物組合，并建立了以該引物組合為核心的LAMP法檢測體系和檢測方法，該方法能快速進(jìn)行核酸擴(kuò)增，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)、檢測成本低的特點(diǎn)。

本發(fā)明采用下述的技術(shù)方案：

一種大腸埃希菌快速核酸檢測的引物組合，所述引物組合為引物組合1，所述引物組合1包括正向內(nèi)引物uidA1-FIP、反向內(nèi)引物uidA1-BIP、正向環(huán)引物uidA1-LoopF、反向環(huán)引物uidA1-LoopB、正向外引物uidA1-F3、反向外引物uidA1-B3；所述引物組合1中各引物序列分別為：

正向內(nèi)引物uidA1-FIP：

GCCCAGTCGAGCATCTCTTCAG-GGATTGGGGCCAACTCCT(序列表序列號1所示)；

反向內(nèi)引物uidA1-BIP：