[發(fā)明專利]一種通過鹽堿地扦插枝條招募林木促生抗逆內(nèi)生真菌的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211273853.3
• 申請日: 2022-10-18
• 公開（公告）號: CN115725415A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鐘非;季文惠;朱蓉;謝東青;李忻桐;劉國元;余春梅;陳艷紅;連博琳;魏輝;張健
• 申請（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12N1/14;C12Q1/04;A01G2/10;A01G22/00;A01B79/02;A01G7/06;C12R1/66;C12R1/79;C12R1/645
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 強(qiáng)萌

1.一種通過鹽堿地扦插枝條招募林木促生抗逆內(nèi)生真菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1)對海岸帶灘涂圍墾區(qū)域進(jìn)行調(diào)查，選取已進(jìn)行水利工程改良的圍墾區(qū)，要求已完成壟狀條田、人工湖或魚塘、溝渠開挖構(gòu)筑，所述區(qū)域能利用溝渠網(wǎng)絡(luò)排鹽、天然雨水洗鹽；

步驟2)在壟狀條田開展調(diào)查，統(tǒng)計地表植物種類與組成，同時取土壤樣品帶回實驗室測定pH值、鹽度、有機(jī)物含量；

步驟3)針對不同鹽度鹽堿地開展針對化治理，具體如下：

步驟3-1)若土壤鹽度＞1.5％，選定試驗區(qū)域，先對壟狀條田土壤進(jìn)行物理與化學(xué)改良，加速淋鹽，增強(qiáng)保墑抗旱能力，改良土壤的鹽分與養(yǎng)分狀況，構(gòu)建先鋒鹽生植物生長環(huán)境；

步驟3-2)若土壤鹽度在1.0％～1.5％，于7月中旬播撒鹽生植物種子，每畝播種量3.0～4.0kg；

步驟3-3)若土壤鹽度在0.5％～1.0％，結(jié)合地表植被分布情況，播撒耐鹽綠肥植物種子，每畝播種量1.0～3.0kg，播后覆蓋秸稈1cm；

步驟3-4)若土壤鹽度＜0.5％，且地表已有較多植物分布，則直接按后續(xù)步驟操作；

步驟4)待試驗區(qū)域植物長成后，收割鹽生植物，同時將其他耐鹽植物用旋耕器械打碎，深耕翻壓入土；3月堆土起壟，壟高35～55cm、寬40～50cm，壟與壟之間形成壟間排鹽水溝，將地膜覆蓋于壟面上抑鹽保墑；

步驟5)選擇步驟3)中鹽度1.0％～1.5％、0.5％～1.0％、＜0.5％的三處試驗區(qū)域，將室內(nèi)培養(yǎng)的耐鹽林木營養(yǎng)缽扦插條置于步驟4)壟面上的種植穴中，覆土平整；在壟面布設(shè)滴灌帶，用于旱季灌溉；

步驟6)待耐鹽林木扦插苗成活后，定期選擇部分生長旺盛的扦插苗，測定林木表型數(shù)據(jù)，同時采集根區(qū)土樣及根系樣本，冷藏保存帶回實驗室分析土壤理化指標(biāo)，并取根系樣本進(jìn)行內(nèi)生真菌分離純化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過鹽堿地扦插枝條招募林木促生抗逆內(nèi)生真菌的方法，其特征在于，還包括步驟7)-步驟11)，具體如下：

步驟7)隨機(jī)選取健康無病害根系樣本，除去表面附著物后，用75％乙醇漂洗30s，之后用無菌水沖洗3次，再用1％次氯酸鈉漂洗5～8min，之后再用無菌水沖洗3次；將消毒后的組織材料用無菌的刀片取植物組織切成0.5cm長的小段后縱切，各處理小塊分別置于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每皿6塊，2個重復(fù)，于28℃恒溫培養(yǎng)3～7d；同時，利用組織印跡法或洗滌液涂布法檢驗表面消毒效果；分離的過程必須嚴(yán)格按照無菌操作的要求，分離的樣品每天觀察一次，連續(xù)觀察一周；

步驟8)發(fā)現(xiàn)有菌絲長出，及時將菌絲連同少量培養(yǎng)基一起挑出，轉(zhuǎn)移到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，記錄編號；將分離到的內(nèi)生真菌于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)；重復(fù)轉(zhuǎn)接多次直至獲得單一菌株；

步驟9)在獲得內(nèi)生真菌的純培養(yǎng)菌株后，將內(nèi)生真菌菌絲體接種于馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中，25℃、120r/min條件下震蕩培養(yǎng)20d，離心，棄上清液，收集菌絲體，置于研缽中加液氮快速研磨，提取內(nèi)生真菌總DNA，采用ITS序列分析進(jìn)行鑒定，利用ITS引物擴(kuò)增序列，PCR產(chǎn)物回收，并進(jìn)行測序，測得序列進(jìn)行序列分析，分析BLAST結(jié)果與形態(tài)屬一致性；對確定的類群構(gòu)建不同屬的數(shù)據(jù)庫，刪選多基因片段后進(jìn)行人工比對，之后分別通過最大簡約法、最大似然法和貝葉斯方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析形態(tài)和分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系確定鑒定結(jié)果；根據(jù)菌落培養(yǎng)特征和菌絲、孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征對純化后的菌落進(jìn)行分類和鑒定；合并分離得到重復(fù)的內(nèi)生真菌后，進(jìn)行統(tǒng)一編號，并采用繼代培養(yǎng)保存法、甘油冷凍保存、低溫冷凍保存法，冷凍真空干燥保存法進(jìn)行菌株保藏和菌種庫構(gòu)建；

步驟10)將已統(tǒng)一編號的菌株逐個進(jìn)行測試，評估耐鹽、產(chǎn)酸、溶磷、產(chǎn)IAA的能力，具體如下：

步驟10-1)耐鹽能力測定：配置NaCl濃度分別為0、200、400、600、800mM/L的五個梯度馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每組5個平行；用無菌打孔器從新鮮培養(yǎng)的真菌菌落邊緣打取菌絲薄片，置于培養(yǎng)基中央，定期測定菌落直徑，在長滿培養(yǎng)皿前至少測定3次；相比于低鹽度培養(yǎng)基，若在高鹽度培養(yǎng)基中菌落直徑變化不大，甚至菌落直徑反而增加，說明該菌株具有較強(qiáng)耐鹽能力；

步驟10-2)產(chǎn)酸能力測定：用無菌打孔器從新鮮培養(yǎng)的真菌菌落邊緣打取菌絲薄片，置于剛果紅培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)3～7d；培養(yǎng)基若出現(xiàn)紫色為陽性，說明菌株產(chǎn)酸；

步驟10-3)溶磷能力測定：用無菌打孔器從新鮮培養(yǎng)的真菌菌落邊緣打取菌絲薄片，置于50mL的馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24h；取50μL菌液點在無機(jī)磷培養(yǎng)基和有機(jī)磷培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h，觀察出現(xiàn)溶磷圈的菌落；測定溶磷圈直徑D與菌落直徑d的比值D/d，用D/d定性檢驗真菌的溶磷能力，比值為1表示無解磷能力，3次重復(fù)；

步驟10-4)產(chǎn)IAA能力測定：將內(nèi)生細(xì)菌接種在1.5mL查氏液體培養(yǎng)基，30℃、200rpm，培養(yǎng)4d，用無菌槍頭取出1mL菌液于滅菌的5mL離心管中，加入2mL Salkowski顯色劑，室溫黑暗顯色20min，出現(xiàn)粉紅色為陽性，說明有IAA產(chǎn)生；

步驟11)根據(jù)步驟10)篩選的具有耐鹽、產(chǎn)酸、溶磷、產(chǎn)IAA能力的內(nèi)生真菌菌株，構(gòu)建擬南芥-真菌或林木扦插條-真菌共培養(yǎng)體系，在不同濃度鹽脅迫條件下，評估在共培養(yǎng)體系接種真菌后對模式植物生長的影響，確認(rèn)篩選出的真菌是否具有協(xié)助植物抵御鹽害的能力。