[發(fā)明專利]一種用于靶向治療腫瘤的重組融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211259846.8
• 申請日: 2022-10-14
• 公開（公告）號: CN115850512A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 生秀梅;王均潔;高迪;張涵;崔璨
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K47/64;A61K38/16;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京智造力知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32382
• 代理人: 朱旭

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于靶向治療腫瘤的重組融合蛋白及其制備方法。本發(fā)明將蛋白傳導(dǎo)域TAT與GLIPR1結(jié)合構(gòu)成融合蛋白來提高GLIPR1的靶向性以及穿透能力，優(yōu)化GLIPR1蛋白主要靠內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的缺陷。本發(fā)明制備的重組融合蛋白TAT?GLIPR1，相較于GLIPR1蛋白而言，細(xì)胞穿透能力顯著增強，提高GLIPR1進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率。可顯著降低藥物使用濃度，減少藥物副作用；與傳統(tǒng)基因療法相比，避免了可能存在的毒性，免疫原性等問題，可作為靶向治療腫瘤的藥物，為GLIPR1靶向治療腫瘤的應(yīng)用提供重要的技術(shù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于靶向治療腫瘤的重組融合蛋白及其制備方法。

技術(shù)背景

膠質(zhì)瘤致病相關(guān)蛋白1（GLIPR1）又稱為RTVP1，最早由Murphy, E.V.等于1995年發(fā)現(xiàn)于人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，全長266個氨基酸殘基，具有一段信號肽和一段跨膜區(qū)段，與PR家族（致病相關(guān)蛋白家族）以及CRISP家族（富含半胱氨酸的分泌蛋白家族）同源。20世紀(jì)末，GLIPR1被發(fā)現(xiàn)作為抑癌基因在前列腺癌中通過誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡及癌基因蛋白的降解發(fā)揮抑癌作用，受p53調(diào)控。肺癌A549細(xì)胞中高表達(dá)GLIPR1后，顯著抑制A549細(xì)胞的生長，GLIPR1還可抑制小鼠肺部異種移植腫瘤的生長。此外，在骨肉瘤、膀胱癌中均發(fā)現(xiàn)GLIPR1的表達(dá)量較低，說明GLIPR1在多種實體瘤中發(fā)揮抑癌作用。經(jīng)腺病毒載體介導(dǎo)的GLIPR1（AdGlipr1）和GLIPR1基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗在前列腺癌小鼠模型中顯示出顯著的抗腫瘤活性。去除跨膜區(qū)段后的GLIPR1蛋白（GLIPR1-ΔTM）可被小鼠前列腺癌細(xì)胞特異性吸收，增加活性氧的產(chǎn)生并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制前列腺癌細(xì)胞異種移植腫瘤的生長。GLIPR1-ΔTM在正常前列腺細(xì)胞以及其他組織細(xì)胞中的吸收率較低，且沒有明顯殺傷作用。由此可見，GLIPR1蛋白對于癌細(xì)胞的靶向性強，可作為一種具有潛力的抗腫瘤藥物研發(fā)。但至今未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面存在GLIPR1受體，如何提高GLIPR1蛋白的細(xì)胞穿透能力是急需解決的問題。

目前，將蛋白引入細(xì)胞的方法很多，包括物理的方法（如微注射、電擊等），化學(xué)或生物打孔（穿孔蛋白、ATP處理），粒子吸收或融合（脂質(zhì)體法、細(xì)胞融合法）。要使這些方法被廣泛應(yīng)用，必須考慮以下問題：大量細(xì)胞能否在相當(dāng)長的一段時間內(nèi)接受試劑的處理；是否需要外界的作用；進(jìn)入細(xì)胞的蛋白量有多少；各個細(xì)胞吸收的劑量是否相同；技術(shù)的可重復(fù)性有多大；細(xì)胞在處理中是否受到傷害，或發(fā)生改變；蛋白能否到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)。上述方法也許在某一特定情況下非常適用，但是局限性很大。

蛋白傳導(dǎo)域（PTD）是近年來在蛋白轉(zhuǎn)運過程中發(fā)現(xiàn)的能高效穿過生物膜的結(jié)構(gòu)域，它不依賴于受體和轉(zhuǎn)運蛋白即可實現(xiàn)對蛋白的轉(zhuǎn)運，且?guī)缀蹩紤]到了上述所有問題。因此，PTD無論是在理論研究還是在基因治療的實際應(yīng)用中都有非常廣泛的研究前景。常見的PTDs有三種：TAT，ANTP和VP22。PTDs的共同之處在于它們均為帶正電荷的多肽片段，富含堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸），能夠?qū)⑸锓肿訋爰?xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，對細(xì)胞無選擇性，具有廣泛的組織相容性、穩(wěn)定性、低免疫原性、可人工合成，程序簡單。其中，TAT來自于HIV-1病毒，序列為YGRKKRRQRRR，是應(yīng)用最為廣泛且效率最高的一種。已有體內(nèi)外實驗證實運用蛋白傳導(dǎo)域?qū)⒅委熕杷幬飩鲗?dǎo)進(jìn)入細(xì)胞及動物體內(nèi)的策略，可大幅度降低藥物的使用濃度，減少副作用，與傳統(tǒng)基因療法相比，具有重要的實際應(yīng)用價值，但尚未見關(guān)于蛋白傳導(dǎo)域與GLIPR1融合蛋白的相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于靶向治療腫瘤的重組融合蛋白及其制備方法。本發(fā)明將蛋白傳導(dǎo)域TAT和GLIPR1蛋白相融合形成重組融合蛋白。其具有廣泛的組織相容性、穩(wěn)定性、低免疫原性以及穿膜能力和靶向性強等優(yōu)點。

本發(fā)明的方案通過如下技術(shù)手段得以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種靶向治療腫瘤的重組融合蛋白，所述的重組融合蛋白為TAT-GLIPR1，是由蛋白傳導(dǎo)域修飾GLIPR1形成的融合蛋白，其氨基酸序列如Seq_1所示。