[發(fā)明專(zhuān)利]一種擬南芥葉片樣本組織解離液及解離方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211257502.3
• 申請(qǐng)日: 2022-10-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115584338A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王翠亭;張倩;張志明;肖云平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/04
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/04
• 代理公司: 蘇州中合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32266
• 代理人: 劉召民

本發(fā)明提供了一種擬南芥葉片樣本組織解離液及解離方法。本發(fā)明使用自主研發(fā)的酶解方案提升了擬南芥葉片的原生質(zhì)體得率，通過(guò)組織表面清洗、樣本剪碎、酶解消化、篩網(wǎng)過(guò)濾、去雜洗滌、細(xì)胞重懸，使得原生質(zhì)體的質(zhì)量較好(活性高，數(shù)量多，雜質(zhì)少)。本發(fā)明在原生質(zhì)體得率上與減少葉綠體的占比上有了明顯的提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及擬南芥葉片樣本解離方法，具體涉及一種擬南芥葉片樣本組織解離液及解離方法。

背景技術(shù)

多細(xì)胞生物的組織和器官由大量高度特化的不同細(xì)胞構(gòu)成，每一種細(xì)胞類(lèi)型都有特定的表型和功能。這些特殊的細(xì)胞類(lèi)型是由未分化的祖細(xì)胞通過(guò)干細(xì)胞基因組的表觀遺傳重編程產(chǎn)生，建立起每個(gè)細(xì)胞獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征。了解細(xì)胞分化的機(jī)制對(duì)于理解多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生等至關(guān)重要，但目前我們對(duì)整個(gè)生物體中細(xì)胞分化、發(fā)育的機(jī)制了解仍然相當(dāng)有限，很大程度上是因?yàn)閺慕M織中純化單個(gè)細(xì)胞類(lèi)型以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表觀分析的技術(shù)難度較高。

以往植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究通常是將植物整個(gè)器官或組織均質(zhì)化后測(cè)序，因此每個(gè)細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度的貢獻(xiàn)變得不可識(shí)別。這種方法雖然有助于在器官或組織水平上解決許多生物學(xué)問(wèn)題，但是無(wú)法了解發(fā)生在罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型或單個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，是研究植物單細(xì)胞水平轉(zhuǎn)錄信息的有效技術(shù)手段。不過(guò)由于植物細(xì)胞周?chē)募?xì)胞壁聚合物和細(xì)胞大小的巨大差異，在植物中進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序明顯比在動(dòng)物中更具挑戰(zhàn)性。植物組織樣本較小，解離出1×10⁶數(shù)量的單細(xì)胞相對(duì)困難。文獻(xiàn)報(bào)道的酶解方式多為纖維素酶過(guò)夜解離，該方法耗時(shí)長(zhǎng)且對(duì)原生質(zhì)體的損傷大，易產(chǎn)生大量的碎片，且過(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，不能反映原始樣本中細(xì)胞真實(shí)的轉(zhuǎn)錄情況。因此解離出高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液尚有較大難度。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明在進(jìn)行了大量的深入研究后，提供了一種擬南芥葉片樣本組織解離液及解離方法。本發(fā)明提供的方法包括組織表面清洗、樣本剪碎、酶解消化、篩網(wǎng)過(guò)濾、去雜洗滌、細(xì)胞重懸，本發(fā)明通過(guò)對(duì)葉片進(jìn)行清洗降低解離過(guò)程中雜菌的污染，采用自主研發(fā)的組織解離液提高解離效率。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了一種擬南芥葉片樣本組織解離液，所述組織解離液是在8％-10％(W/V)甘露醇溶液中添加1％-3％(W/V)纖維素酶、1％-3％(W/V)果膠酶。

其中，W/V(g/mL)表示質(zhì)量體積濃度。“8％-10％甘露醇溶液”是指甘露醇在水溶液中的質(zhì)量體積濃度為8％-10％，“添加1％-3％纖維素酶”是指添加的纖維素酶在8％-10％甘露醇溶液中的質(zhì)量體積濃度為1％-3％，同樣“添加1％-3％果膠酶”是指添加的果膠酶在8％-10％甘露醇溶液中的質(zhì)量體積濃度為1％-3％。

優(yōu)選地，所述組織解離液是添加有2％纖維素酶、2％果膠酶的8％甘露醇溶液。

本發(fā)明還提供了一種擬南芥葉片樣本的解離方法，包括：

(1)表面清洗：將擬南芥葉片樣本用甘露醇溶液進(jìn)行表面清洗；

(2)樣本剪碎：將步驟(1)清洗后的葉片置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入甘露醇溶液浸沒(méi)過(guò)葉片、將葉片切成細(xì)條狀；

(3)酶解消化：將步驟(2)得到的葉片細(xì)條轉(zhuǎn)移至組織解離液中酶解得到原生質(zhì)體，所述組織解離液是添加有1％-3％纖維素酶、1％-3％果膠酶的8％-10％甘露醇溶液；

(4)篩網(wǎng)過(guò)濾：將步驟(3)消化后的懸液置于碎冰上，然后篩網(wǎng)過(guò)濾、離心富集、棄消化液；

(5)去雜洗滌：向步驟(4)得到的原生質(zhì)體沉淀中加入甘露醇溶液離心洗滌；

(6)細(xì)胞重懸：向步驟(5)離心后的細(xì)胞沉淀中加入甘露醇溶液進(jìn)行重懸。