[發(fā)明專利]一種擬南芥葉片樣本組織解離液及解離方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211257502.3
• 申請(qǐng)日: 2022-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN115584338A
• 公開（公告）日: 2023-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王翠亭;張倩;張志明;肖云平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04
• 代理公司: 蘇州中合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32266
• 代理人: 劉召民

1.一種擬南芥葉片樣本組織解離液，所述組織解離液是在8％-10％甘露醇溶液中添加1％-3％纖維素酶、1％-3％果膠酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬南芥葉片樣本組織解離液，其特征在于，所述組織解離液是添加有2％纖維素酶、2％果膠酶的8％甘露醇溶液。

3.一種擬南芥葉片樣本的解離方法，包括：

(1)表面清洗：將擬南芥葉片樣本用甘露醇溶液進(jìn)行表面清洗；

(2)樣本剪碎：將步驟(1)清洗后的葉片置于無菌培養(yǎng)皿中，加入甘露醇溶液浸沒過葉片、將葉片切成細(xì)條狀；

(3)酶解消化：將步驟(2)得到的葉片細(xì)條轉(zhuǎn)移至組織解離液中酶解得到原生質(zhì)體，所述組織解離液是添加有1％-3％纖維素酶、1％-3％果膠酶的8％-10％甘露醇溶液；

(4)篩網(wǎng)過濾：將步驟(3)消化后的懸液置于碎冰上，然后篩網(wǎng)過濾、離心富集、棄消化液；

(5)去雜洗滌：向步驟(4)得到的原生質(zhì)體沉淀中加入甘露醇溶液離心洗滌；

(6)細(xì)胞重懸：向步驟(5)離心后的細(xì)胞沉淀中加入甘露醇溶液進(jìn)行重懸。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種擬南芥葉片樣本的解離方法，其特征在于，步驟(1)中，從擬南芥植株中取2-3cm長的葉片2-3片，用甘露醇溶液進(jìn)行表面清洗2-3次，每次2-3min。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種擬南芥葉片樣本的解離方法，其特征在于，步驟(3)中，酶解溫度為室溫，酶解時(shí)間為4-5h。

6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的一種擬南芥葉片樣本的解離方法，其特征在于，步驟(3)中，酶解在轉(zhuǎn)速10-15rpm的雜交爐中進(jìn)行。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種擬南芥葉片樣本的解離方法，其特征在于，步驟(4)中，先使用70μm篩網(wǎng)過濾，再使用30μm篩網(wǎng)過濾。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種擬南芥葉片樣本的解離方法，其特征在于，步驟(4)和(5)中，離心條件均為：離心力100g，離心溫度4-10℃，離心時(shí)間2-5min。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種擬南芥葉片樣本的解離方法，其特征在于，步驟(6)中，所述重懸的具體步驟為棄上清后留50μl，加入1ml 8％甘露醇溶液，用寬口的膠頭滴管輕柔吹打混勻。

10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種擬南芥葉片樣本的解離方法，其特征在于，步驟(1)、(2)、(5)和(6)中，使用的甘露醇溶液的質(zhì)量體積濃度均為8％。