[發明專利]新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法和應用

在審

• 申請號: 202211249337.7
• 申請日: 2022-10-12
• 公開（公告）號: CN116083377A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 張致淏
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/24;C12N15/863;C12N5/10;A61K38/20;A61K48/00;A61P1/16;A61P35/00
• 代理公司: 鄭州豫乾知識產權代理事務所(普通合伙) 41161
• 代理人: 裴樂樂

新型重組痘苗病毒VV?IL?37的構建方法和應用，涉及癌癥治療技術領域，包括如下步驟：步驟(一)重組質粒pEGFP?IL?37?N1的構建：經過引物設計、擴增、酶切、瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、連接、轉化、搖菌、質粒提取步驟得到pEGFP?IL?37?N1質粒；步驟(二)重組痘苗病毒VV?IL?37/VV?IL?37?GFP的生成與包裝，采用該方法構建的重組痘苗病毒VV?IL?37?GFP具有強感染能力和優異的IL?37基因表達能力，且該新型重組痘苗病毒VV?IL?37可用于在制備肝癌藥物。

技術領域

本發明涉及癌癥治療技術領域，具體涉及新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法和應用。

背景技術

肝癌是最常見的高致死性的惡性實體腫瘤疾病之一，其治療一直是臨床的重點和難點。由于肝癌具有嚴重的耐藥特性，目前臨床使用的化療藥物難以達到可期的治療效果，且副作用明顯。當肝癌病程進入晚期時，現有的治療手段更是收效甚微。因此，尋找和開發新的治療藥物和手段，是提高肝癌臨床治療效果的關鍵。

病毒基因工程藥物作為有望大幅提高癌癥治療效果甚至攻克癌癥的新型藥物，進一步開發和發展此類藥物，是突破肝癌臨床治療局限的重要方向之一。

發明內容

基于以上不足，本發明提出新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法，采用該方法構建的重組痘苗病毒VV-IL-37-GFP具有強感染能力和優異的IL-37基因表達能力，且該新型重組痘苗病毒VV-IL-37可用于在制備肝癌藥物。

本發明提供如下技術方案，包括以下步驟：

步驟(一)重組質粒pEGFP-IL-37-N1的構建：經過引物設計、擴增、酶切、瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、連接、轉化、搖菌、質粒提取步驟得到pEGFP-IL-37-N1質粒；

步驟(二)重組痘苗病毒VV-IL-37/VV-IL-37-GFP的生成與包裝：

(2.1)取處于對數生長期的293細胞，制備成細胞懸液，然后鋪到細胞培養皿中，放入CO₂恒溫細胞培養箱中培養；

(2.2)用無血清的DMEM細胞培養基配制野生型痘苗病毒工作液，隨后，將病毒工作液加入293細胞中，并放于CO₂細胞培養箱孵育，使病毒吸附細胞；

(2.3)取1上述pEGFP-IL-37-N1質粒加到離心管中，再依次加入EC?buffer和Enhancer?buffer，輕輕混勻后，室溫放置；

(2.4)向離心管中加入Effectene轉染液，用移液槍輕輕吹打混勻后，室溫放置；

(2.5)之后向離心管加入DMEM細胞培養基，輕輕混勻，即為質粒轉染工作液；

(2.6)取出293細胞，棄掉上清，用PBS輕輕清洗三次，隨后，加入質粒轉染工作液，再添加DMEM細胞培養基，混勻后，放入CO₂細胞培養箱中培養；

(2.7)之后收集細胞上清液，放于離心機中離心1；離心完成后，用濾器過濾細胞上清液，隨后，

(2.8)將細胞上清液移入超速離心管中，并置于超速離心機中離心；離心完成后，棄掉上清，加入病毒保存液，充分溶解，即為生成并包裝好的重組痘苗病毒VV-IL-37/VV-IL-37-GFP。

優選地，步驟(1)中：根據GenBank中IL-37的序列分別設計用于上下游引物，并引入雙酶切位點。

優選地，步驟(1)中擴增步驟為：以合成的IL-37cDNA為模板，用設計的IL-37特異性引物進行PCR及promega?GoTaq?DNA聚合酶進行PCR擴增。