[發明專利]新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法和應用在審
| 申請號： | 202211249337.7 | 申請日： | 2022-10-12 |
| 公開（公告）號： | CN116083377A | 公開（公告）日： | 2023-05-09 |
| 發明（設計）人： | 張致淏 | 申請（專利權）人： | 鄭州大學第一附屬醫院 |
| 主分類號： | C12N7/01 | 分類號： | C12N7/01;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/24;C12N15/863;C12N5/10;A61K38/20;A61K48/00;A61P1/16;A61P35/00 |
| 代理公司： | 鄭州豫乾知識產權代理事務所(普通合伙) 41161 | 代理人： | 裴樂樂 |
| 地址： | 450000 河*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 新型 重組 痘苗 病毒 vv il 37 構建 方法 應用 | ||
1.新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟(一)重組質粒pEGFP-IL-37-N1的構建：經過引物設計、擴增、酶切、瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、連接、轉化、搖菌、質粒提取步驟得到pEGFP-IL-37-N1質粒；
步驟(二)重組痘苗病毒VV-IL-37/VV-IL-37-GFP的生成與包裝：
(2.1)取處于對數生長期的293細胞，制備成細胞懸液，然后鋪到細胞培養皿中，放入CO2恒溫細胞培養箱中培養；
(2.2)用無血清的DMEM細胞培養基配制野生型痘苗病毒工作液，隨后，將病毒工作液加入293細胞中，并放于CO2細胞培養箱孵育，使病毒吸附細胞；
(2.3)取1上述pEGFP-IL-37-N1質粒加到離心管中，再依次加入EC?buffer和Enhancerbuffer，輕輕混勻后，室溫放置；
(2.4)向離心管中加入Effectene轉染液，用移液槍輕輕吹打混勻后，室溫放置；
(2.5)之后向離心管加入DMEM細胞培養基，輕輕混勻，即為質粒轉染工作液；
(2.6)取出293細胞，棄掉上清，用PBS輕輕清洗三次，隨后，加入質粒轉染工作液，再添加DMEM細胞培養基，混勻后，放入CO2細胞培養箱中培養；
(2.7)之后收集細胞上清液，放于離心機中離心1；離心完成后，用濾器過濾細胞上清液，隨后，
(2.8)將細胞上清液移入超速離心管中，并置于超速離心機中離心；離心完成后，棄掉上清，加入病毒保存液，充分溶解，即為生成并包裝好的重組痘苗病毒VV-IL-37/VV-IL-37-GFP。
2.根據權利要求1所述的新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法，其特征在于：步驟(1)中：根據GenBank中IL-37的序列分別設計用于上下游引物，并引入雙酶切位點。
3.根據權利要求1所述的新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法，其特征在于：步驟(1)中擴增步驟為：以合成的IL-37cDNA為模板，用設計的IL-37特異性引物進行PCR及promega?GoTaq?DNA聚合酶進行PCR擴增。
4.根據權利要求1所述的新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法，其特征在于：步驟(1)中酶切步驟為：用限制性內切酶EcoRI和BamH1分別對回收的PCR產物和pEGFP-N1空載體進行37℃雙酶切過夜。
5.根據權利要求1所述的新型重組痘苗病毒VV-IL-37的構建方法，其特征在于：步驟(1)中轉化步驟為：
(1)配制LB固體培養基，放入高壓鍋滅菌后室溫靜置2h；
(2)然后向配好的LB固體培養基中加入抗生素；
(3)將以前凍的感受態大腸桿菌DH5α放在冰上，使其慢慢恢復室溫；
(4)加入100-200ng質粒，緩慢的用1mL移液槍吹打混勻，整個過程都要在冰上進行，繼續孵育30min；
(5)提前打開水浴鍋并將其設置為42℃，將上述孵育完畢的感受態大腸桿菌DH5α于42℃水浴鍋中孵育90s后，依舊放回冰上冷卻2min；
(6)向感受態大腸桿菌DH5α中加入DMEM培養基，打開恒溫搖床，將其放在搖床上上孵育45min；
(7)將孵育結束的感受態大腸桿菌DH5α均勻的涂在LB培養基上，倒置于37℃細菌培養箱中過夜培養。
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