[發(fā)明專利]應(yīng)用LFD-RPA技術(shù)檢測菠蘿泛菌的引物、探針、試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211245221.6
• 申請日: 2022-10-12
• 公開（公告）號: CN115948581A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊雪;徐會永;臧昊昱;谷春艷;潘銳;戚仁德
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 高寧馨

本發(fā)明公開了一種應(yīng)用LFD?RPA技術(shù)檢測菠蘿泛菌的引物、探針、試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述的引物基于菠蘿泛菌的一個(gè)假定蛋白Hypothetical?protein基因序列設(shè)計(jì)；所述的引物的上游引物Pa?F序列如SEQ?ID?No:1所示，所述的引物的下游引物Pa?R序列如SEQ?ID?No:2所示，所述的探針Pa?Probe序列如SEQ?ID?No:3所示。利用待測樣品的研磨液進(jìn)行LFD?RPA檢測，根據(jù)LFD試紙條的條帶確定待測樣品是否含有菠蘿泛菌。該技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)分子檢測對專業(yè)儀器和專業(yè)技術(shù)人員的依賴，實(shí)現(xiàn)對菠蘿泛菌的快速檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增側(cè)流層技術(shù)(LFD-RPA)快速檢測菠蘿泛菌的引物、探針、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

菠蘿泛菌（ Pantoea?ananatis）是一類重要的植物病原細(xì)菌，可導(dǎo)致植物產(chǎn)生枯萎、腐爛、葉斑、頂梢枯死等癥狀。菠蘿泛菌可引起水稻、洋蔥、甜櫻桃、甜瓜、茶樹、菠蘿、甘蔗等眾多大宗作物和經(jīng)濟(jì)作物的細(xì)菌性病害，并造成嚴(yán)重危害。

傳統(tǒng)的細(xì)菌性病害的檢測速度較慢，且需要PCR儀等高精尖儀器設(shè)備，主要適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測，無法滿足快速檢測的需求，使其應(yīng)用受到限制。重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（recombinase?plolymerase?amplification，RPA）是一項(xiàng)利用重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)，該技術(shù)不僅可以擺脫對高值儀器的需求，且反應(yīng)時(shí)間短，通過與熒光基團(tuán)標(biāo)記，RPA技術(shù)可與側(cè)流層析試紙條(lateral?flow?dipsticks，LFD)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的可視化檢測，不需復(fù)雜儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場快速檢測，可以實(shí)現(xiàn)病原物高特異性、高靈敏度的可視化快速檢測，具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前尚未有關(guān)于應(yīng)用LFD-RPA技術(shù)檢測菠蘿泛菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

要解決的問題

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何方便、快速、靈敏地檢測菠蘿泛菌，擺脫傳統(tǒng)分子檢測對專業(yè)儀器和專業(yè)技術(shù)人員的依賴，實(shí)現(xiàn)對菠蘿泛菌的快速檢測，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

技術(shù)方案

為解決上述問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案。

一種應(yīng)用LFD-RPA技術(shù)檢測菠蘿泛菌的引物和探針，所述的引物基于菠蘿泛菌的一個(gè)假定蛋白Hypothetical?protein基因序列設(shè)計(jì)；

所述的引物的上游引物Pa-F序列如SEQ?ID?No:1所示，

所述的引物的下游引物Pa-R序列如SEQ?ID?No:2所示，

所述的探針Pa-Probe序列如SEQ?ID?No:3所示。

上述所述的應(yīng)用LFD-RPA技術(shù)檢測菠蘿泛菌的引物和探針，所述的引物的下游引物Pa-R的5’端用生物素標(biāo)記。

上述所述的應(yīng)用LFD-RPA技術(shù)檢測菠蘿泛菌的引物和探針，所述的探針Pa-Probe的5’端用FITC基團(tuán)標(biāo)記，其5’端起第33位與第34位堿基中標(biāo)記THF，其3’端用PHO基團(tuán)標(biāo)記。

一種含有上述所述的引物和探針的試劑盒。

如上述所述的試劑盒，所述的試劑盒還包括LFD試紙條。

所述的引物和探針在菠蘿泛菌檢測中的應(yīng)用。

所述的引物和探針在制備用于檢測菠蘿泛菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

所述的試劑盒在菠蘿泛菌檢測中的應(yīng)用。

上述所述的試劑盒在菠蘿泛菌檢測中的應(yīng)用，其應(yīng)用的方法，包括以下步驟：

利用待測樣品的研磨液進(jìn)行LFD-RPA檢測；根據(jù)LFD試紙條的條帶確定待測樣品是否含有菠蘿泛菌。