[發明專利]用于檢測人類中性粒細胞抗原基因分型的引物組合、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202211240389.8
• 申請日: 2022-10-11
• 公開（公告）號: CN116083551A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 李恒聰;吳國光;鐘周琳;周燕;李麗蘭;陳潔潤;盧芳;蔣麗紅;莫慧慧
• 申請（專利權）人: 南寧中心血站（南寧輸血醫學研究所）
• 主分類號: C12Q1/6881
• 分類號: C12Q1/6881;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體涉及用于檢測人類中性粒細胞抗原基因分型的引物組合、試劑盒及方法。本發明針對人類粒細胞抗原HNA?1?5系統全部11個SNP位點設計了正向引物、反向引物和延伸引物，序列如SEQ?ID?No:1?22所示，應用所述引物組合檢測人類中性粒細胞抗原基因分型的方法，可實現每批96個或384個樣品的批量檢測，高通量檢測將為相關臨床診斷和科研工作帶來很大的便利，大大節約實驗時間，且檢測方法準確、穩定。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體涉及用于檢測人類中性粒細胞抗原基因分型的引物組合、試劑盒及方法。

背景技術

人類中性粒細胞抗原(Human?Neutrophil?Antigens，HNA)是在人類中性粒細胞粒細胞表面表達的一組糖蛋白，在同種和自身免疫中起重要作用。個體HNA抗原的差異可以導致輸血后產生粒細胞抗體。目前證實HNA抗原、抗體在多種臨床疾病中起重要的作用，包括新生兒同種免疫性粒細胞減少癥(NIN)、自身免疫性粒細胞減少癥、發熱性非溶血性輸血反應、輸血相關性急性肺損傷(TRALI)、骨髓移植后同種免疫性粒細胞減少癥、輸血相關性同種免疫性粒細胞減少癥、藥物誘導的粒細胞減少癥和粒細胞輸注無效等。因此研究HNA抗原具有重要的臨床意義。

人類中性粒細胞抗原定義和相關命名法由國際輸血協會粒細胞免疫學工作組(ISBT?GIWP)HNA命名法規范，并基于相關糖蛋白上的血清學定義表位。采用符號HNA表示人類中性粒細胞抗原，不同抗原系統用數字表示，同一糖蛋白不同的多態性則根據發現先后順序用小寫英文字母表示，如HNA-la、HNA-lb、HNA-1c等。ISBT?GIWP已將14個HNA等位基因正式分配給5個HNA抗原系統。

目前HNA特異性鑒定方法主要有血清學方法和基因分型方法。血清學鑒定HNA抗原或抗體方法主要有粒細胞凝集試驗、粒細胞免疫熒光試驗(GIFT)、單克隆抗體特異性粒細胞抗原捕獲試驗(Monoclonal?Antibody?Immobilization?of?Granulocyte?Antigen,MAIGA)、流式細胞術和ELISA等方法。HNA抗原系統的基因分型方法主要有PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)、實時定量PCR(RT-qPCR)、基于PCR的測序(PCR-SBT)等。

鑒定HNA抗原特異性的血清學方法盡管簡單、便宜、與臨床關系緊密，但存在耗時多、通量低、依賴抗血清等缺點。現主要應用的HNA抗原系統基因分型方法中：PCR-SSP法需要進行多管擴增，雖然操作簡單、試劑便宜，但存在通量低、實驗操作工作量大等缺點；RT-qPCR具有多重擴增的優點，但存在檢測通量不高、實驗檢測試劑成本較高等缺點；PCR-SBT法具有能直接檢測序列、發現新突變的優點，但存在檢測成本高、分析相對復雜、通量不高等缺點。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的缺陷，提供用于檢測人類中性粒細胞抗原基因分型的引物組合、試劑盒及方法。

第一方面，本發明提供用于檢測人類中性粒細胞抗原基因分型的引物組合，檢測的基因位點及對應的正向引物、反向引物和延伸引物的序列如下表所示：

第二方面，本發明提供一種用于檢測人類中性粒細胞抗原基因分型的試劑盒，包括所述的引物組合。

第三方面，本發明提供應用所述引物組合檢測人類中性粒細胞抗原基因分型的方法，包括以下步驟：

S1、提取待測樣本DNA；

S2、以S1的DNA為模板，使用多重PCR技術擴增含有目的SNP的DNA序列，擴增引物為上述的正向引物和反向引物；

S3、擴增的PCR產物SAP處理后，利用上述的延伸引物進行單堿基延伸；

S4、獲得的單堿基延伸產物，轉移到SpectroCHIP芯片上，進行質譜檢測，確定其基因型。