[發(fā)明專利]基于mNGS檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品中病原微生物的方法建立及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211225857.4
• 申請(qǐng)日: 2022-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115927565A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張同存;劉宇;祝海川;吳寒;孫釩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢波睿達(dá)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/689;C12Q1/6893;C12Q1/6895;C12Q1/6888;C12Q1/70;G16B30/10;C12R1/32;C12R1/35;C12R1/01
• 代理公司: 北京君有知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11630
• 代理人: 焦麗雅

本發(fā)明提出了基于mNGS(metagenomic?next?generation?sequencing，宏基因組測(cè)序)技術(shù)檢測(cè)CAR?T細(xì)胞制品中病原微生物的方法及應(yīng)用，屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。一種基于mNGS技術(shù)檢測(cè)CAR?T細(xì)胞制品中病原微生物的方法，包括：S1.基于mNGS檢測(cè)CAR?T細(xì)胞制品的核酸提取；S2.基于mNGS檢測(cè)CAR?T細(xì)胞制品的文庫(kù)制備；S3.基于mNGS檢測(cè)CAR?T細(xì)胞制品的測(cè)序；S4.分析CAR?T細(xì)胞制品測(cè)序數(shù)據(jù)。本發(fā)明建立了一種高效的、規(guī)范的、易于標(biāo)準(zhǔn)化的、能夠用于CAR?T細(xì)胞制品快速放行的檢測(cè)方法。通過(guò)大大縮短CAR?T細(xì)胞制品外源性病原微生物風(fēng)險(xiǎn)因子的檢測(cè)時(shí)間，能極大縮短患者等待CAR?T細(xì)胞產(chǎn)品的時(shí)間，從而更好地造福患者、服務(wù)臨床。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于mNGS技術(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品中病原微生物的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來(lái)，CAR-T細(xì)胞療法發(fā)展迅速，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，為臨床治療帶來(lái)了革命性的影響。目前，國(guó)內(nèi)外已有8款針對(duì)血液腫瘤的CAR-T產(chǎn)品上市。同行業(yè)內(nèi)公司目前使用的產(chǎn)品檢測(cè)方法主要針對(duì)于生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞用到的慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒中間制品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法主要包括培養(yǎng)法和Q-PCR法。獲批放行的每批次慢病毒制品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，但存在檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、檢測(cè)范圍單一等缺陷。

2017年，國(guó)家食藥監(jiān)總局(CFDA)官網(wǎng)發(fā)布《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》，該原則指出：細(xì)胞治療產(chǎn)品的檢測(cè)機(jī)制建議采用中間樣品的質(zhì)量檢驗(yàn)和終產(chǎn)品放行檢驗(yàn)相結(jié)合的方法；產(chǎn)品放行檢測(cè)的項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)可參考國(guó)外已上市品種。

2020年第四版《中國(guó)藥典》在《藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》一文指出：在控制藥品微生物質(zhì)量中，微生物實(shí)驗(yàn)室出于各種原因，如成本、生產(chǎn)量、快速簡(jiǎn)便及提高藥品質(zhì)量等需要而采用非藥典規(guī)定的檢驗(yàn)方法(即替代方法)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行替代方法的驗(yàn)證，確認(rèn)其應(yīng)用效果優(yōu)于或等同于藥典的方法。

宏基因組測(cè)序，全稱為宏基因組新一代測(cè)序技術(shù)(metagenomics?next-generation?sequencing，mNGS)，是綜合分析樣本內(nèi)微生物和宿主的基因物質(zhì)(DNA和RNA)的方法。由于其檢測(cè)范圍廣、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)，mNGS已廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)保、工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。如今，mNGS被頻頻用于臨床微生物檢測(cè)服務(wù)，應(yīng)用于多種感染性疾病的診斷、微生物學(xué)分析、識(shí)別腫瘤相關(guān)病毒等多個(gè)方面。

目前，存在用mNGS技術(shù)檢測(cè)各種臨床樣本的大量報(bào)道，但尚無(wú)研究機(jī)構(gòu)或企業(yè)將mNGS技術(shù)用于CAR-T細(xì)胞制品的病原微生物檢測(cè)或產(chǎn)品放行。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提出基于mNGS技術(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品中病原微生物的方法及應(yīng)用，具有快捷、便利、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)效果。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種基于mNGS技術(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品中病原微生物的方法，包括：

S1.基于mNGS檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品的核酸提取：

對(duì)供試品進(jìn)行核酸提取，并采用去人源和非去人源樣品前處理；

對(duì)樣本分別進(jìn)行DNA和RNA提取，將提取后的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

S2.基于mNGS檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品的文庫(kù)制備：

使用DNA文庫(kù)制備試劑盒對(duì)所提取的核酸分別建庫(kù)，其中，核酸包括提取后的DNA，以及RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)后得到的cDNA；

S3.基于mNGS檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品的測(cè)序：

對(duì)所述兩種核酸文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序；

依據(jù)所述樣本標(biāo)簽序列和文庫(kù)標(biāo)簽序列對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，得到對(duì)應(yīng)于不同樣本的測(cè)序讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)；