[發(fā)明專利]基于mNGS檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品中病原微生物的方法建立及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211225857.4
• 申請(qǐng)日: 2022-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN115927565A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張同存;劉宇;祝海川;吳寒;孫釩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢波睿達(dá)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/689;C12Q1/6893;C12Q1/6895;C12Q1/6888;C12Q1/70;G16B30/10;C12R1/32;C12R1/35;C12R1/01
• 代理公司: 北京君有知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11630
• 代理人: 焦麗雅

1.一種基于mNGS技術(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品中病原微生物的方法，其特征在于，包括：

S1.基于mNGS檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品的核酸提?。?/p>

對(duì)供試品進(jìn)行核酸提取，并采用去人源和非去人源樣品前處理；

對(duì)樣本進(jìn)行DNA和RNA提取，提取后的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

S2.基于mNGS檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品的文庫(kù)制備：

使用DNA文庫(kù)制備試劑盒對(duì)所提取的核酸分別建庫(kù)，其中，核酸包括提取后的DNA，以及RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)后得到的cDNA；

S3.基于mNGS檢測(cè)CAR-T細(xì)胞制品的測(cè)序：

對(duì)所述兩種核酸文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序；

依據(jù)所述樣本標(biāo)簽序列和文庫(kù)標(biāo)簽序列對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，得到對(duì)應(yīng)于不同樣本的測(cè)序讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)；

S4.分析CAR-T細(xì)胞制品測(cè)序數(shù)據(jù)：

將測(cè)序數(shù)據(jù)與華大基因病原微生物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，得到每個(gè)樣本的分析結(jié)果；

若mNGS分析結(jié)果顯示CAR-T細(xì)胞制品未檢出病原微生物，且同批次樣本經(jīng)傳統(tǒng)方法檢測(cè)后也未檢出微生物，則判定該制品滿足放行要求。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述供試品包括新鮮CAR-T細(xì)胞制品、凍存CAR-T細(xì)胞制品，所述CAR-T細(xì)胞來(lái)源于健康供體或者患者體內(nèi)的T細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述CAR-T細(xì)胞包括從健康供體或者患者體內(nèi)獲得的T細(xì)胞一直到體外培養(yǎng)、刺激、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增之后的成品CAR-T細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述CAR-T細(xì)胞包括以CD30為靶點(diǎn)的細(xì)胞制品，也包含其他所有靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞制品。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟S4中所述比對(duì)分析包括：

S41.對(duì)所述測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾；

S42.將過(guò)濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)與宿主基因組進(jìn)行比對(duì)，去除比對(duì)到所述宿主基因組的序列；

S43.將未比對(duì)到所述宿主基因組的序列與病原微生物基因組進(jìn)行比對(duì)；

S44.統(tǒng)計(jì)比對(duì)到所述病原微生物基因組的序列的檢測(cè)參數(shù)，獲得包括特異比對(duì)序列數(shù)、覆蓋率、覆蓋深度、背景微生物、相對(duì)豐度中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)參數(shù)在內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果；

S45.輸出所述檢測(cè)結(jié)果。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述宿主基因組包括人類參考基因組序列和炎黃基因組序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，步驟S43中所述與病原微生物基因組進(jìn)行比對(duì)，基于下列中的至少之一確定所述測(cè)序數(shù)據(jù)中來(lái)自于所述病原微生物的測(cè)序數(shù)據(jù)：

(1)保留所述測(cè)序數(shù)據(jù)中比對(duì)長(zhǎng)度占比大于90％的序列；

(2)保留所述測(cè)序數(shù)據(jù)中錯(cuò)配堿基數(shù)小于5％的序列；

(3)保留具有比對(duì)特異性的序列，其中所述具有比對(duì)特異性的序列為唯一比對(duì)序列或多比對(duì)結(jié)果中滿足次優(yōu)比對(duì)分值除以最優(yōu)比對(duì)分值小于0.8的序列，其中所述唯一比對(duì)序列是唯一比對(duì)到所述病原微生物基因組一個(gè)位置上的序列。

8.一種如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用。