[發(fā)明專利]嗜熱鏈球菌FUA329及其發(fā)酵生產(chǎn)尿石素A的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211224627.6
• 申請日: 2022-10-09
• 公開（公告）號: CN115747098A
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 房耀維;劉姝;楊光;候曉月;劉琪彤;葉沁文
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/06;C12N1/02;C12N1/38;C12Q1/04;A61K39/285;A61P31/20;C12R1/46
• 代理公司: 南京專信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32605
• 代理人: 郝曉燕

1.一種嗜熱鏈球菌FUA329，該菌株已經(jīng)于2022年5月23日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC NO.24963。

2.權(quán)利要求1所述的嗜熱鏈球菌FUA329用于產(chǎn)尿石素A。

3.一種組合物用于制備改善腸道菌群藥物的用途，其特征在于，所述組合物含有權(quán)利要求1所述的嗜熱鏈球菌FUA329。

4.如權(quán)利要求1所述的嗜熱鏈球菌FUA329的篩選方法，包括以下步驟：

i)驗證產(chǎn)尿石素A的母乳樣本：在無菌條件下，將母乳樣本接種到含有鞣花酸的ABB液體培養(yǎng)基中，厭氧條件下培養(yǎng)4天，以含鞣花酸不含母乳的培養(yǎng)基和含母乳不含鞣花酸的培養(yǎng)基做對照，每天收集一次樣本，用有機溶劑C₂H₃N:H₂O:HCOOH(80：19.9：0.1,V:V:V:)等體積萃取，進(jìn)行HPLC和HPLC-MS/MS分析，篩選出產(chǎn)尿石素A的母乳樣本；

ii)篩選產(chǎn)尿石素A的菌株：用已被驗證產(chǎn)尿石素A的母乳樣本發(fā)酵液，添加生理鹽水稀釋后，取0.1mL涂布在ABB固體平板上，在厭氧條件下培養(yǎng)之后，獲取多個微生物菌落，每個菌落分別接種于含有鞣花酸的ABB液體培養(yǎng)基中，并在厭氧條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，對發(fā)酵液進(jìn)行HPLC和HPLC-MS/MS分析，篩選出產(chǎn)尿石素A的菌株，命名為FUA329。

5.如權(quán)利要求1所述的所述嗜熱鏈球菌FUA329用于產(chǎn)尿石素A的方法，包括以下步驟：

1)菌種活化：取-80℃冰箱里保藏于甘油管中的FUA329于ABB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線，獲得單菌落；

2)種子培養(yǎng)：將活化得到的菌株FUA329的單菌落接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲取種子液；

3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液接種于添加了鞣花酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

4)分離提取：將發(fā)酵液離心，所得上清液即為尿石素A粗提取液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)尿石素A的方法，其特征在于，所述步驟1)中的ABB固體培養(yǎng)基配方為添加有2％瓊脂的ABB厭氧基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)尿石素A的方法，其特征在于，所述步驟2)中的的種子培養(yǎng)基為ABB厭氧基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基，pH6.8±0.2，其配方包括：蛋白胨16.0g/l，酵母浸粉7.0g/l，氯化鈉5.0g/l，淀粉1.0g/l，葡萄糖1.0g/l，丙酮酸鈉1.0g/l，精氨酸1.0g/l，琥珀酸鈉0.5g/l，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/l，碳酸氫鈉0.4g/l，焦磷酸鐵0.5g/l，氯化血紅素0.005g/l，維生素K0.0005g/l，巰基乙酸鈉0.5g/l，二硫蘇糖醇1.0g/l；所述步驟2)中的培養(yǎng)條件為在37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)尿石素A的方法，其特征在于，所述步驟3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基為含20μM鞣花酸的ABB厭氧基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)尿石素A的方法，其特征在于，所述步驟3)中的種子液的接種量為2％，發(fā)酵培養(yǎng)條件為在37℃厭氧條件下培養(yǎng)48h。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)尿石素A的方法，其特征在于，所述步驟4)中的離心條件為在12000×g、4℃離心10min。