[發明專利]一種提純dsRNA的方法

在審

• 申請號: 202211221681.5
• 申請日: 2022-10-08
• 公開（公告）號: CN115404236A
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發明（設計）人: 唐雪明;秦斌鈺;肖建輝
• 申請（專利權）人: 硅羿科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明

本發明提供了一種提純dsRNA的方法，將大腸桿菌發酵后的菌體破碎并離心分離，獲取液相，液相經中空纖維柱過濾，所得濾液經緩沖液調節電導率和pH后即為上樣樣品，最后上樣樣品經過柱層析的梯度洗脫獲取dsRNA。該提純方法獲得的dsRNA純度在90％以上,由于步驟簡單，收率達到85％以上；提純方法未使用有機溶劑和昂貴的蛋白純化平臺，綠色環保，經濟節能；可以輕松的等比例放大，從1L放大到100L，且規模化之后效果更好。

技術領域

本發明屬于生物農藥技術領域，尤其涉及一種提純dsRNA的方法。

背景技術

RNA干擾技術(RNA silencing)也叫基因沉默技術，原理是經過特殊設計的dsRNA進入昆蟲體內后，Dicer酶將其切割成20個堿基對左右的siRNA，siRNA反義鏈與RISC蛋白結合，特異性的識別mRNA對其進行切割，使其失去翻譯蛋白能力，切割下的片段又會進行下一個循環，導致昆蟲死亡。

國內外已經有效地將RNA干擾技術應用于殺蟲殺病毒領域，如RenaissanceBioscience使用dsRNA殺滅馬鈴薯甲蟲，殺滅率高達98.3％；GreenLight Biosciences使用dsRNA殺滅瓦螨取得了很好的效果。由此可見，RNA干擾技術應用在植保，動保和人保上會有非常大的應用前景。

目前，dsRNA的合成方法主要有體外轉錄法和微生物發酵法。體外轉錄法需要用到大量昂貴的酶，成本巨大，后續提純的費用昂貴，不利于大規模放大；生物發酵法是目前降低dsRNA成本最可行的方法，但是傳統生物發酵法的提取步驟繁瑣，價格昂貴，如CN114891782 A的酚氯仿法純化RNA中，破碎細胞經過氯仿試劑等有機溶劑抽提，再經過沉淀、洗滌和晾干，最后溶解；該方法需要用到大量有機溶劑，不利于人體和環境，不可能大規模放大。CN113136383A公開了一種適用于規模化提取dsRNA的方法，包括菌體的預處理、緩沖液的配制和添加、兩步法均質、切向流濃縮、填料的預處理、兩步法結合洗脫，提取得到的dsRNA在低溫干燥后純度可達90％以上，收率可到80％以上；但是該方法步驟繁瑣，還需要用到酒精等有機溶劑，不涉及純化洗脫，規模化放大還未實施。CN114921457A公開了一種提取dsRNA的方法，主要包括粗提液的處理、正壓-鐘罩式二聯過濾和醇沉等步驟。該方法制備的dsRNA純度在97％以上，但是該方法主要突出二聯過濾的功效，一樣要用到酒精洗脫，不涉及純化洗脫，規模化放大還未實施。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種綠色環保、經濟節能、純度好、收率高，并且可以規模化放大的dsRNA提純方法。

本發明公開了一種提純dsRNA的方法，包括以下步驟：

(1)樣品預處理，向大腸桿菌發酵后的菌體中加入緩沖液1調節pH為5-9，攪拌使菌體分散懸浮，使用高壓均質機將分散的菌體破碎，再經離心機高速離心后收集液相；

(2)樣品再處理，向液相中加入鹽，攪拌溶解，低溫0-4℃放置至分層；倒出的上清液，經中空纖維柱過濾，獲得濾液；使用緩沖液2調節濾液電導率為48-55S/m，使用緩沖液3調節濾液pH為5-9，即獲得上樣樣品；

(3)獲取dsRNA，上樣樣品經蠕動泵上樣，至柱層析中的填料吸附飽和，采用濃度遞增的緩沖液4進行三次梯度洗脫，第三次洗脫收集樣品；

其中，所述緩沖液1由氯化銨溶液和氯化鉀溶液配制而成；

所述緩沖液2由氯化鉀溶液、磷酸二氫鉀溶液和三羥甲基氨基甲烷溶液配制而成；

所述緩沖液3由氯化鉀溶液、磷酸二氫鉀溶液和三羥甲基氨基甲烷溶液配制而成；

所述緩沖液4由氯化鉀溶液和三羥甲基氨基甲烷溶液配制而成。

根據本發明，所述步驟(1)中所述的緩沖液1由600mM的氯化銨和450mM的氯化鉀按體積比1:6～6:1配制而成。