[發明專利]一種提純dsRNA的方法在審
| 申請號： | 202211221681.5 | 申請日： | 2022-10-08 |
| 公開（公告）號： | CN115404236A | 公開（公告）日： | 2022-11-29 |
| 發明（設計）人： | 唐雪明;秦斌鈺;肖建輝 | 申請（專利權）人： | 硅羿科技（上海）有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104 | 代理人： | 繆利明 |
| 地址： | 201314 上海*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 提純 dsrna 方法 | ||
1.一種提純dsRNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)樣品預處理，向大腸桿菌發酵后的菌體中加入緩沖液1調節pH為5-9，攪拌使菌體分散懸浮，使用高壓均質機將分散的菌體破碎，再經離心機高速離心后收集液相；
(2)樣品再處理，向液相中加入鹽，攪拌溶解，低溫0-4℃放置至分層；倒出的上清液，經中空纖維柱過濾，獲得濾液；使用緩沖液2調節濾液電導率為48-55S/m，使用緩沖液3調節濾液pH為5-9，即獲得上樣樣品；
(3)獲取dsRNA，上樣樣品經蠕動泵上樣，至柱層析中的填料吸附飽和，采用濃度遞增的緩沖液4進行三次梯度洗脫，第三次洗脫收集樣品；
其中，所述緩沖液1由氯化銨溶液和氯化鉀溶液配制而成；
所述緩沖液2由氯化鉀溶液、磷酸二氫鉀溶液和三羥甲基氨基甲烷溶液配制而成；
所述緩沖液3由氯化鉀溶液、磷酸二氫鉀溶液和三羥甲基氨基甲烷溶液配制而成；
所述緩沖液4由氯化鉀溶液和三羥甲基氨基甲烷溶液配制而成。
2.根據權利要求1所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述的緩沖液1由600mM的氯化銨和450mM的氯化鉀按體積比1:6～6:1配制而成。
3.根據權利要求1所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述高壓均質機的壓力為5000-15000psi，所述離心機的轉速為5000-10000rpm。
4.根據權利要求1所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述的鹽選自硫酸鈉、硫化銨或氯化銨中的一種或多種。
5.根據權利要求1所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述的緩沖液2由350mM的氯化鉀、110mM的磷酸二氫鉀和10mM的三羥甲基氨基甲烷按體積比10:5:3～30:2:1配制而成。
6.根據權利要求1所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述中空纖維柱的濾膜孔徑為0.45-5μm。
7.根據權利要求1所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述的緩沖液3由300mM的氯化鉀、50mM的磷酸二氫鉀和10mM的三羥甲基氨基甲烷按體積比1:5:3～10:2:1配制而成。
8.根據權利要求1所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述的填料為表面改性的二氧化硅。
9.根據權利要求8所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述填料由三種不同粒徑的填料1、填料2和填料3按體積比1:3:5-1:1:1組成，其中：
所述填料1的粒徑為5-25μm、填料2的粒徑為25-55μm、填料3的粒徑為55-95μm。
10.根據權利要求1所述的提純dsRNA的方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述用于梯度洗脫的緩沖液4按以下三種濃度梯度配制：
緩沖液4-1：由350mM的氯化鉀和20mM的三羥甲基氨基甲烷按體積比1:3-10:1配制而成；
緩沖液4-2：由375mM的氯化鉀和25mM的三羥甲基氨基甲烷按體積比1:3-10:1配制而成；
緩沖液4-3：由375mM的氯化鉀和40mM的三羥甲基氨基甲烷按體積比1:3-10:1配制而成。
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