[發明專利]一種模塊化組裝雙組分納米顆粒制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202211220721.4
• 申請日: 2022-10-07
• 公開（公告）號: CN115960259A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 劉澤輝;何放
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/01;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/866;A61K39/187;A61K39/12;A61P31/14;A61P31/20;B82Y5/00;B82Y40/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明屬于分子生物學及生物醫學技術領域，涉及嵌合豬圓環病毒樣顆粒的制備，以及雙組分納米顆粒在疫苗領域的應用。本發明公開了基于PCV2VLP的二聯疫苗的制備方法：將SpyCatcher基因融合到PCV2Cap蛋白的C端構建Cap?SC?VLP，同時表達攜帶SpyTag的CSFV?E2蛋白；基于SpyTag和SpyCatcher之間的異肽鍵形成，ST?GFP和E2?ST在體外與Cap?SC?VLP表面暴露的SpyCatcher結合，從而實現ST?GFP和E2?ST全長蛋白在PCV2VLP的表面展示。本發明的CSFV?PCV2二聯顆粒疫苗Cap?E2NPs在細胞免疫方面表現出明顯的性能提升。

技術領域

本發明屬于分子生物學及生物醫學技術領域，涉及嵌合豬圓環病毒樣顆粒的制備，以及雙組分納米顆粒在疫苗領域的應用。

背景技術

疫苗免疫失敗是豬瘟病毒(CSFV)不斷復發和流行的一個重要原因。臨床上造成CSFV免疫失敗的主要原因除了不合理的免疫程序、母源抗體干擾、持續性感染造成的免疫耐受，還有豬群中其它病原感染造成的免疫抑制。豬圓環病毒2型(PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)作為免疫抑制性病原，在獸醫臨床具有很高的檢出率。有流行病學調查顯示，有15.87％的豬場中存在CSFV-PRRSV共感染，有13.06％的豬場中存在CSFV-PCV2共感染，甚至CSFV-PRRSV-PCV2三重感染的豬場也達到了9.53％，這很可能是PCV2和PRRSV相關的免疫抑制引起的。以PCV2為例，其對淋巴組織具有首選的細胞噬性，從而負調節胸腺中T細胞選擇過程，導致病豬明顯的淋巴耗竭和免疫抑制。這些免疫抑制性因素的存在使得CSFV的防控和凈化更加困難。因此，研發二聯疫苗針對CSFV和這些免疫抑制性病原同時免疫，可能是一種可供選擇的防控策略。

Cap蛋白是PCV2唯一的衣殼蛋白。PCV2病毒樣顆粒(VLPs)由60個Cap單體組裝而成，并已成功開發作為商品化疫苗預防PCV2感染。這些疫苗接種后可顯著緩解與PCV2相關的臨床癥狀和病理變化。目前，已有研究表明PCV2?VLP可作為有效的抗原載體來遞送外源蛋白或表位，從而誘導針對外源性抗原的免疫反應。研究人員通過將外源多肽融合在PCV2Cap的N端或C端，從而構建多種基于Cap融合蛋白的嵌合PCV2?VLPs[191,249]。值得注意的是，這些融合蛋白并未損害PCV2?Cap骨架的自組裝能力。然而，由于Cap?N端隱藏在衣殼內并參與組裝后的病毒基因組包裝，融合在PCV2?Cap的N端的外源多肽很可能也被包埋，而不會展示在嵌合PCV2?VLP的表面。外源多肽插入到Cap的C末端構建的嵌合PCV2?VLPs，免疫后可在豬體和小鼠中同時誘導針對PCV2?Cap和外源多肽的抗體。因此，Cap的C端適合插入外源多肽構建嵌合PCV2?VLPs，可應用于開發多聯疫苗。

然而，以上嵌合PCV2?VLPs的研究僅限于通過基因融合的方式，遞送的外源抗原也僅限于多肽。目前還沒有研究報道攜帶較大外源蛋白的嵌合PCV2?VLPs疫苗。利用基因融合將外源表位或多肽整合到VLPs中很大程度上受限于插入多肽的大小和空間結構，插入分子量大、三維結構復雜的蛋白質往往對VLP組裝、溶解性、蛋白質折疊以及VLP穩定性造成負面影響。由于CSFV?E2結構復雜，有很多中和表位都是構象依賴的，因此E2的正確折疊直接關系到免疫保護效力。新出現的SpyCatcher/SpyTag技術結合了基因融合和標簽偶聯的優勢，可允許在VLP上展示分子量更大且結構更復雜的蛋白質。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：克服現有技術中的不足，為了更好地防控CSFV和PCV2的混合感染，提出了一種基于PCV2?VLP的二聯疫苗研發策略。