[發明專利]一種模塊化組裝雙組分納米顆粒制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202211220721.4
• 申請日: 2022-10-07
• 公開（公告）號: CN115960259A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 劉澤輝;何放
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/01;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/866;A61K39/187;A61K39/12;A61P31/14;A61P31/20;B82Y5/00;B82Y40/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.基于PCV2?VLP的二聯疫苗的制備方法，其特征在于：將SpyCatcher基因融合到PCV2Cap蛋白的C端構建Cap-SC?VLP，同時表達攜帶SpyTag的CSFV?E2蛋白；

基于SpyTag和SpyCatcher之間的異肽鍵形成，ST-GFP和E2-ST在體外與Cap-SC?VLP表面暴露的SpyCatcher結合，從而實現ST-GFP和E2-ST全長蛋白在PCV2?VLP的表面展示；所述目的基因Cap-SC、E2-ST的編碼序列分別如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示。

2.根據權利要求1所述的基于PCV2?VLP的二聯疫苗的制備方法，其特征在于：

目的基因Cap-SC的抗原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；

目的基因E2-ST的抗原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

3.豬瘟病毒自組裝蛋白納米顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)pET28a-Cap-SC原核表達載體構建和蛋白表達；

(2)HTA-E2-ST的構建和蛋白表達；

(3)純化的E2-ST在體外與Cap-SC?VLPs偶聯以構建雙組分Cap-GFP納米顆粒。

4.根據權利要求3所述的豬瘟病毒自組裝蛋白納米顆粒的制備方法，其特征在于：

(1)pET28a-Cap-SC原核表達載體構建和蛋白表達：

Cap-SpyCatcher構建包括N端6×His標簽、PCV2?Cap、柔性linker和截短的SpyCatcher，針對大腸桿菌密碼子偏好性進行優化后，采用基因合成的方式合成；然后通過體外同源重組的方法將編碼Cap-SC的DNA序列克隆到大腸桿菌表達載體pET28a中，構建pET28a-Cap-SC；重組質粒pET28a-Cap-SC轉化到大腸桿菌Transetta，誘導蛋白表達，并純化獲得Cap-SC融合蛋白；

(2)HTA-E2-ST的構建和蛋白表達：

SP-E2-Spytag構建包括N端分泌信號肽SP23、CSFV?E2ZJ蛋白、SpyTag和6xHis標簽，通過融合PCR合成；然后通過體外同源重組的方法將編碼E2-ST的DNA序列克隆到桿狀病毒表達載體pFastBac?HTA構建HTA-E2-ST；HTA-E2-ST轉化DH10Bac，隨后按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統說明書，經Tn7轉座、藍白斑篩選、桿粒提取和轉染獲得重組桿狀病毒；將重組桿狀病毒感染足量的昆蟲細胞，純化獲得E2-ST融合蛋白；

(3)純化的E2-ST在體外與Cap-SC?VLPs偶聯以構建雙組分Cap-GFP納米顆粒：

Cap-SC?VLPs與E2-ST以1:4的摩爾比混合，獲得雙組分納米顆粒Cap-E2?NPs。

5.CSFV-PCV2二聯顆粒疫苗的制備方法，其特征在于：利用雙組分納米顆粒Cap-E2NPs，將Cap-E2?NPs與Seppic?206水佐劑充分混合、乳化，制得納米顆粒疫苗。

6.如權利要求4所述方法制備獲得的雙組分納米顆粒Cap-E2?NPs疫苗在制備防治豬瘟病毒感染藥物中的應用。