[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用雙酶級(jí)聯(lián)重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211213497.6
• 申請(qǐng)日: 2022-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116254279A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林建強(qiáng);安高;溫鑫;林建群
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東大學(xué);青島龍鼎生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/53
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/53;C12N15/61;C12N15/70;C12P19/02;C12P19/24;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發(fā)明公開(kāi)了一種利用雙酶級(jí)聯(lián)重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L?木糖的方法，是合成木糖醇?4?脫氫酶基因和L?海藻糖異構(gòu)酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a?xdh/L?fucI繼而構(gòu)建重組菌株、利用獲得的重組菌株E.coliBL21(DE3)?pET28a?xdh/L?fucI作為生物催化劑催化廉價(jià)底物木糖醇生產(chǎn)L?木糖。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)XDH和L?FucI酶，通過(guò)離心的方式即可容易地得到細(xì)胞催化劑，不需要額外對(duì)酶進(jìn)行純化或是固定化等耗時(shí)耗力的操作，反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)效率高且成本低，反應(yīng)液中L?木糖的濃度達(dá)到52.2g/L，L?木糖的轉(zhuǎn)化率為65％。本發(fā)明為木糖醇生產(chǎn)L?木糖提供了一種替代方法，具有顯著的工業(yè)應(yīng)用潛力和應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物合成L-木糖的方法，尤其涉及一種利用雙酶級(jí)聯(lián)重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

稀有糖是一類(lèi)自然界中極少存在的單糖及其衍生物，在無(wú)熱量甜味劑、抗病毒藥物、抗癌或腫瘤治療藥物、藥物構(gòu)建前體和L-核苷類(lèi)似物等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。近年來(lái)，人們對(duì)L-碳水化合物及其核苷類(lèi)化合物的研究越來(lái)越多。

L-木糖是一種醛戊糖，已被用作合成許多藥用分子的原始材料。據(jù)相關(guān)報(bào)道，新型L-木糖衍生物在體內(nèi)對(duì)尿糖重吸收有抑制作用，提示其可能用于治療糖尿病。L-木糖還可用作生產(chǎn)多羥基吡咯烷和相關(guān)類(lèi)似物的前體，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，作為α和β-葡萄糖苷酶抑制劑，用于生產(chǎn)抗HBV的核苷類(lèi)藥物。此外，L-木糖通過(guò)氧化還原反應(yīng)可以得到L-核糖衍生物，L-核糖衍生物再經(jīng)糖基化可得到L-核糖核酸苷，例如L-尿苷、L-胞苷、L-腺苷、L-鳥(niǎo)苷等。

通過(guò)化學(xué)方法，以D-葡萄糖或D-葡萄糖內(nèi)酯為底物，經(jīng)多步反應(yīng)可以合成L-木糖。然而，該方法操作復(fù)雜，產(chǎn)量低，不適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)，酶或全細(xì)胞形式的生物催化已經(jīng)成為一種有價(jià)值的工具，用于開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的稀有糖生產(chǎn)方法，以取代繁瑣的化學(xué)合成方法。因此，L-木糖的生物合成因其反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少以及催化效率高而備受關(guān)注。

目前，L-木糖的生物合成主要以L-木酮糖為底物實(shí)現(xiàn)。例如，來(lái)自于Pseudomonasstutzeri的L-鼠李糖異構(gòu)酶和來(lái)自于E.coli的L-海藻糖異構(gòu)酶都能夠催化L-木酮糖為L(zhǎng)-木糖。然而，上述反應(yīng)過(guò)程具有酶底物專(zhuān)一性差、催化活性低、生產(chǎn)效率低，而且底物L(fēng)-木酮糖價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，不適合商業(yè)化生產(chǎn)L-木糖。因此，探索一種操作簡(jiǎn)單、效率高且成本低的規(guī)模化生產(chǎn)L-木糖的方法非常迫切。經(jīng)檢索，有關(guān)利用雙酶級(jí)聯(lián)重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種利用雙酶級(jí)聯(lián)重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法。

本發(fā)明所述的利用雙酶級(jí)聯(lián)重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，步驟是：

(1)合成木糖醇-4-脫氫酶基因和L-海藻糖異構(gòu)酶基因

木糖醇-4-脫氫酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，或是與SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且編碼與SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；

L-海藻糖異構(gòu)酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示，或是與SEQ?IDNO.4所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且編碼與SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-xdh/L-fucI