[發明專利]一種利用雙酶級聯重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法

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• 申請號: 202211213497.6
• 申請日: 2022-09-30
• 公開（公告）號: CN116254279A
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 林建強;安高;溫鑫;林建群
• 申請（專利權）人: 山東大學;青島龍鼎生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/61;C12N15/70;C12P19/02;C12P19/24;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種利用雙酶級聯重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，步驟是：

(1)合成木糖醇-4-脫氫酶基因和L-海藻糖異構酶基因

木糖醇-4-脫氫酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，或是與SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且編碼與SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；

L-海藻糖異構酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示，或是與SEQ?ID?NO.4所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且編碼與SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)構建重組質粒pET28a-xdh/L-fucI

將木糖醇-4-脫氫酶基因xdh連接到載體質粒pET28a的限制性酶切位點BamHI和HindIII之間，構建得到重組質粒pET28a-xdh；將L-海藻糖異構酶基因L-fucI連接到重組質粒pET28a-xdh的限制性酶切位點HindIII和Xho?I之間，得到重組質粒pET28a-xdh/L-fucI；其中PCR克隆獲得的L-海藻糖異構酶基因L-fucI所用上游引物含有核糖體結合位點AAGGAG；

(3)構建重組菌株

將重組質粒pET28a-xdh/L-fucI以1:10的體積比加入表達感受態細胞中，冰浴30min，再在42℃水浴中熱擊45s，立即冰浴2min，而后加入LB液體培養基中37℃，200rpm復蘇1h，再將菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體平板上，37℃靜置培養過夜；挑取單菌落轉接至LB液體培養基中，并添加卡那霉素至濃度為50μg/ml，37℃，200rpm培養12h，得到重組菌株；其中，所述感受態細胞是E.coli?DH5α或E.coli?BL21(DE3)，得到的重組菌株相應是E.coliDH5-pET28a-xdh/L-fucI或E.coli?BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI；

(4)誘導培養收集菌體

將重組菌株E.coli?BL21(DE3)-pET28a-xdh/L-fucI接種于含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基中，37℃，200rpm培養至OD₆₀₀為0.6，然后加入誘導劑IPTG至終濃度為0.1mM，并將溫度降低到25℃繼續誘導培養12h；培養后的菌液10000rpm離心5min收集菌體；

(5)利用收集的菌體作為生物催化劑轉化木糖醇生產L-木糖

將收集的菌體用50mM、pH?10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液洗滌菌體3±1次，離心收集菌體，用底物溶液重懸菌體至OD₆₀₀為77-82構建生物合成L-木糖的反應體系，置于38-42℃恒溫水浴鍋中反應27-32h；其中，所述底物溶液由78-83g/L木糖醇、7.3-7.8mM?Zn²⁺、50mMpH為10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制；將反應后的反應液于14000rpm離心5min去除菌體，取上清液煮沸5min后再重復一次離心，取上清液經0.22μm孔徑超濾膜濾器過濾，濾液即為含L-木糖溶液。

2.根據權利要求1所述利用雙酶級聯重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步驟(1)所述木糖醇-4-脫氫酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；所述L-海藻糖異構酶基因L-fucI的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示。

3.根據權利要求1所述利用雙酶級聯重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步驟(5)所述生物合成L-木糖的反應體系中木糖醇的濃度為79-81g/L，Zn²⁺的濃度為7.4-7.6mM，重組菌濁度OD₆₀₀為79-81，溶液為50mMpH為10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

4.根據權利要求3所述利用雙酶級聯重組大腸桿菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法，其特征在于：步驟(5)所述生物合成L-木糖的反應體系中木糖醇的濃度為80g/L，Zn²⁺的濃度為7.5mM，重組菌濁度OD₆₀₀為80，溶液為50mMpH為10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。