[發(fā)明專利]用于精準快速鑒定水稻轉(zhuǎn)基因后代純合株系的擴增引物及其鑒定方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202211210785.6 | 申請日： | 2022-09-30 |
| 公開（公告）號： | CN115976015A | 公開（公告）日： | 2023-04-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 郭芾;舒慶堯;曾文卓;汪慶;錢秋;馮云艷 | 申請（專利權(quán)）人： | 海南浙江大學研究院 |
| 主分類號： | C12N15/11 | 分類號： | C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202 | 代理人： | 王美燕 |
| 地址： | 572024 海南省三亞市崖*** | 國省代碼： | 海南;46 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 精準 快速 鑒定 水稻 轉(zhuǎn)基因 后代 純合株系 擴增 引物 及其 方法 | ||
本發(fā)明提供用于精準快速鑒定水稻轉(zhuǎn)基因后代純合株系的擴增引物及其鑒定方法，根據(jù)載體插入基因組的情況，在單拷貝株系中T?DNA插入位點的兩側(cè)側(cè)翼序列分別設(shè)計跨插入位點的引物wing?F/R，同時在T?DNA區(qū)域設(shè)計一對引物mcherry?F/R，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1?6所示，本發(fā)明通過根據(jù)插入位點的兩側(cè)側(cè)翼序列設(shè)計獲得跨插入位點的引物wing?F/R，并在T?DNA區(qū)域設(shè)計一對引物mcherry?F/R，從而實現(xiàn)通過1次PCR擴增即可在T1代單株中快速精準地鑒定獲得水稻轉(zhuǎn)基因后代單拷貝純合株系，結(jié)果清晰，純系與雜合植株的PCR結(jié)果差異顯著，無需分析計算或特殊儀器。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及用于精準快速鑒定水稻轉(zhuǎn)基因后代純合株系的擴增引物及其鑒定方法。
背景技術(shù)
植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因功能研究和分子育種領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。如何快速有效地從轉(zhuǎn)基因后代中檢測出純合的植株，是鑒定目標基因效應的必需環(huán)節(jié)，也是轉(zhuǎn)基因植物研究的重要環(huán)節(jié)。現(xiàn)有常規(guī)的的鑒定方法為先對轉(zhuǎn)基因植株進行拷貝數(shù)的鑒定，找出單拷貝的株系，再通過PCR檢測或qPCR技術(shù)，分析其T1代植株中的純合體和雜合體；或者對T2代轉(zhuǎn)基因苗的轉(zhuǎn)入基因分離情況進行分析。
目前拷貝數(shù)的鑒定方法有兩種：一種是直接通過后代植株攜帶轉(zhuǎn)入基因的分離比例來推算T0代植株的拷貝數(shù)，一般陽性：陰性為3：1可以推測為單拷貝。此方法比較粗略，有時受到種子萌發(fā)率的影響，不夠準確，而且需要一定的基數(shù)，耗費大量的后代轉(zhuǎn)基因苗。另一種是采用Southern?blot技術(shù)對轉(zhuǎn)基因當代(T0代)植株進行鑒定，此方法比較準確，但費工費時，對DNA的提取質(zhì)量、濃度、Southern?blot實驗技術(shù)有比較高的要求；而且Southernblot僅能鑒定出拷貝數(shù)，不能獲知T-DNA在植物基因組上的插入位置和旁側(cè)序列。隨著高通量測序的普及，全基因組測序的費用驟降，各種測序數(shù)據(jù)的分析平臺也隨之涌現(xiàn)，因此，通過全基因組測序及分析平臺分析轉(zhuǎn)基因株系的插入位點成為了更方便與精確的選擇。基于全基因組測序下，尋找可用于精準快速鑒定水稻轉(zhuǎn)基因后代純合株系的擴增引物及其鑒定方法，對于植物轉(zhuǎn)基因植株鑒定與研究提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明提出一種用于精準快速鑒定水稻轉(zhuǎn)基因后代純合株系的擴增引物及其鑒定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：
本發(fā)明提供一種用于精準快速鑒定水稻轉(zhuǎn)基因后代純合株系的擴增引物，根據(jù)載體插入基因組的情況，在單拷貝株系中T-DNA插入位點的兩側(cè)側(cè)翼序列分別設(shè)計跨插入位點的引物wing?F/R，同時在T-DNA區(qū)域設(shè)計一對引物mcherry?F/R。
進一步說明，所述引物mcherry?F/R的核苷酸序列如：SEQ?ID?NO.1-2所示。
進一步說明，在單拷貝株系中T-DNA插入位點的兩側(cè)側(cè)翼500bp序列上設(shè)計跨插入位點的引物wing?F/R。
進一步說明，根據(jù)M2單拷貝株系和M7單拷貝株系的不同載體插入基因組的情況，所述跨插入位點的引物wing?F/R分別為引物M2?wing?F/R和M7?wing?F/R。
進一步說明，所述M2單拷貝株系的載體插入基因組的情況為：載體的RB-LB區(qū)間插入基因組中的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物；所述M7單拷貝株系的載體插入基因組的情況為載體整個序列都插入了基因組中的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物。
進一步說明，所述引物M2?wing?F/R的核苷酸序列如：SEQ?ID?NO.3-4所示；所述M7wing?F/R的核苷酸序列如：SEQ?ID?NO.5-6所示。
一種水稻轉(zhuǎn)基因后代純合株系的鑒定方法，包括如下步驟：
步驟1：通過采用全基因組測序和CTREP-finder平臺分析，確定T0代轉(zhuǎn)基因植物的T-DNA插入的拷貝數(shù)、準確位置和側(cè)翼序列；
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