[發明專利]用于精準快速鑒定水稻轉基因后代純合株系的擴增引物及其鑒定方法

在審

• 申請號: 202211210785.6
• 申請日: 2022-09-30
• 公開（公告）號: CN115976015A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 郭芾;舒慶堯;曾文卓;汪慶;錢秋;馮云艷
• 申請（專利權）人: 海南浙江大學研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6869
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 王美燕

1.一種用于精準快速鑒定水稻轉基因后代純合株系的擴增引物，其特征在于：根據載體插入基因組的情況，在單拷貝株系中T-DNA插入位點的兩側側翼序列分別設計跨插入位點的引物wing?F/R，同時在T-DNA區域設計一對引物mcherry?F/R。

2.如權利要求1所述的一種用于精準快速鑒定水稻轉基因后代純合株系的擴增引物，其特征在于：所述引物mcherry?F/R的核苷酸序列如：SEQ?ID?NO.1-2所示。

3.如權利要求1所述的一種用于精準快速鑒定水稻轉基因后代純合株系的擴增引物，其特征在于：在單拷貝株系中T-DNA插入位點的兩側側翼500bp序列上設計跨插入位點的引物wing?F/R。

4.如權利要求3所述的一種用于精準快速鑒定水稻轉基因后代純合株系的擴增引物，其特征在于：根據M2單拷貝株系和M7單拷貝株系的不同載體插入基因組的情況，所述跨插入位點的引物wing?F/R分別為引物M2?wing?F/R和M7?wing?F/R。

5.如權利要求4所述的一種用于精準快速鑒定水稻轉基因后代純合株系的擴增引物，其特征在于：所述M2單拷貝株系的載體插入基因組的情況為：載體的RB-LB區間插入基因組中的單拷貝轉基因植物；所述M7單拷貝株系的載體插入基因組的情況為載體整個序列都插入了基因組中的單拷貝轉基因植物。

6.如權利要求4所述的一種用于精準快速鑒定水稻轉基因后代純合株系的擴增引物，其特征在于：所述引物M2?wing?F/R的核苷酸序列如：SEQ?ID?NO.3-4所示；所述M7?wing?F/R的核苷酸序列如：SEQ?ID?NO.5-6所示。

7.一種使用如權利要求1～5中任意一項所述的擴增引物鑒定水稻轉基因后代純合株系的鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1：通過采用全基因組測序和CTREP-finder平臺分析，確定T₀代轉基因植物的T-DNA插入的拷貝數、準確位置和側翼序列；

步驟2：根據載體插入基因組的情況，在單拷貝株系中T-DNA插入位點的兩側側翼500bp序列上設計wing?F/R引物對，同時聯合在T-DNA區域設計mcherry?F/R引物對；

步驟3：采用步驟2獲得的2對引物組合，對轉基因后代不同基因型的基因組DNA進行一次PCR擴增，即可在T1代單株中鑒定獲得純合株系。

8.如權利要求7所述的一種水稻轉基因后代純合株系的鑒定方法，其特征在于：根據M2單拷貝株系的載體插入基因組的情況，所述引物組合為M2?wing?F/R和mcherry?F/R。

9.如權利要求6所述的一種水稻轉基因后代純合株系的鑒定方法，其特征在于：根據M7單拷貝株系的載體插入基因組的情況，所述引物組合為M7?wing?F/R和mcherry?F/R。

10.如權利要求6所述的一種水稻轉基因后代純合株系的鑒定方法，其特征在于：所述PCR擴增的程序為：95℃3min預變性；95℃，15s，60℃，30s，72℃，1min，35個循環；72℃延伸7min；PCR產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。