[發明專利]一種綿羊DQB基因的1號外顯子的擴增引物對、sg序列和應用

在審

• 申請號: 202211210723.5
• 申請日: 2022-09-30
• 公開（公告）號: CN116064506A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 許橋;陳燕;劉秋月;王海濤;馬潤林
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/12;C12N15/10;C12N15/113;C12N15/85;C12N15/64
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

本發明提供了一種綿羊DQB基因的1號外顯子的擴增引物對、sg序列和應用，涉及基因工程技術領域。本發明所述擴增引物對，可特異性擴增綿羊DQB基因的1號外顯子區域，以擴增得到的該區域為靶基因，設計兩對sg序列，通過引導CRISPR/Cas9發生基因編輯后可造成大片段缺失并導致移碼突變，對DQB基因編碼的蛋白質結構和功能造成較大破壞，有利于后續在體細胞或個體中進行DQB的基因編輯。在本發明實施例中，利用上述sg序列可以在湖羊胎兒成纖維細胞中實現編輯并獲得基因編輯的單克隆細胞，篩選獲得63個單克隆細胞株，測序后，基因編輯陽性率為66.7％，雙等位基因均發生編輯的概率為28.6％。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種綿羊DQB基因的1號外顯子的擴增引物對、sg序列和應用。

背景技術

利用CRISPR/Cas9系統進行基因編輯時，需要首先根據基因組序列設計sg(single-guide，單鏈引導)序列，目標基因中一般可設計多個sg序列，但序列的位置堿基順序會對其編輯靶基因的效率有影響，使用高編輯效率的sg序列更容易獲得目標基因編輯的細胞或受精卵，可為獲得基因編輯細胞或動物個體減少實驗時間及成本。CRISPR/Cas9技術為目前最常用的基因編輯技術，此前所用的同源重組、ZFN(鋅指核酸酶)、TANLEN(轉錄激活樣效應核酸酶)等技術實現也可以目的基因的大片段精確敲除，但細胞內自然發生同源重組的效率極低(10^-6)。ZFN、TALEN技術的設計繁瑣，成本更高且效率較低，而CRISPR/Cas9技術的基因編輯效率較高，并可以介導同源重組，相比于ZFN和TALEN，Cas9系統更具優勢。

DQB(major?histocompatibility?complex,class?II,DQ?beta)屬于MHC?II類抗原DQβ鏈。DQB約為26-28kDa，包含6個外顯子。外顯子1編碼前導肽，外顯子2和外顯子3編碼兩個胞外結構域，外顯子4編碼跨膜結構域，外顯子5編碼胞質尾。MHC?II類抗原有很多基因，但MHC-DQ是僅有的兩個能在蛋白質水平上表達的基因之一，其中DQB基因位點所編碼的MHC抗原在其免疫系統中發揮重要作用，其第二外顯子編碼的功能區(抗原結合區)具有豐富的多態性。目前對DQB基因功能的研究目前尚不夠明確，通過基因編輯技術有助于對DQB功能進行驗證，但是目前并沒有針對綿羊DQB基因進行編輯的報道，沒有針對DQB基因使用CRISPR/Cas9系統實現編輯的實例。

發明內容

本發明的目的提供一種綿羊DQB基因的1號外顯子的擴增引物對、sg序列和應用，基因編輯效率高，通過引導CRISPR/Cas9發生基因編輯后可造成大片段缺失并導致移碼突變，有助于DQB基因功能的研究。

本發明提供了一種綿羊DQB基因的1號外顯子的擴增引物對，包括DQBF1和DQBR1，其中DQBF1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，DQBR1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明還提供了利用上述擴增引物對擴增綿羊DQB基因的1號外顯子的方法，包括以下步驟，以綿羊基因組DNA為模板，與上述擴增引物對配制PCR擴增體系，進行PCR擴增，得到所述綿羊DQB基因的1號外顯子；

所述PCR擴增的程序，包括：95℃預變性5min；95℃變性30s，59.5℃退火30s，72℃延伸45s，34循環；72℃再延伸5min。

優選的，所述PCR擴增體系以25μL計，包括DQBF1?1μL、DQBR1?1μL、DNA模板1μL、2×Mix?12.5μL和余量的H₂O。

本發明還提供了以上述方法擴增得到的綿羊DQB基因的1號外顯子為靶基因設計的sg序列。

優選的，所述sg序列包括兩對單鏈寡核苷酸序列：DQBsg1-F和DQBsg1-R，及DQBsg2-F和DQBsg2-R；