[發明專利]用于檢測大麗輪枝菌的引物組合、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202211203289.8
• 申請日: 2022-09-29
• 公開（公告）號: CN116064905A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發明（設計）人: 王永林;陳琦;唐晨;黃建東
• 申請（專利權）人: 北京林業大學;北京昌回林海生態科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 李正

本發明涉及一種用于檢測大麗輪枝菌的引物組合、試劑盒及應用。所述引物組合包括RPA引物對和crRNA；所述RPA引物對的靶標基因包括大麗輪枝菌ITS基因；所述crRNA的靶標基因包括大麗輪枝菌ITS基因。本發明提供的引物組合、試劑盒將RPA擴增技術和CRISPR檢測技術結合起來，實現了對大麗輪枝菌的快速檢測，具有靈敏度高，特異性強，檢測效率高的優點。將本發明所述引物組合、試劑盒應用于大麗輪枝菌的檢測，對因大麗輪枝菌感染導致的黃櫨枯萎病的防治具有重要意義。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種用于檢測大麗輪枝菌的引物組合、試劑盒及應用。

背景技術

黃櫨(Cotinus?coggygria)為漆樹科(Anacardiaceae)黃櫨屬(Cotinus)植物，落葉灌木或小喬木，秋季葉色變紅，極具觀賞價值和經濟價值，是北京香山公園秋季紅葉景觀的主要樹種。自上世紀80年代香山發現黃櫨枯萎病以來，其發生有逐年加重的趨勢。該病害導致黃櫨葉片萎蔫，同時自葉緣向內發黃，或失水卷曲，但通常不脫落；根、莖的維管束出現壞死，木質部與皮層交界處出現褐色帶線，部分樹杈迅速死亡，發病嚴重時可導致整株長勢衰弱或死亡。

黃櫨枯萎病的病原菌為大麗輪枝菌(Verticillium?dahliae)，其無性世代屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)輪枝孢屬(Verticillium)，菌落表面常形成黑色微菌核，其溫度適應范圍較寬，具有耐高溫特性。大麗輪枝菌為典型土壤習居菌，土壤中的微菌核萌發產生的菌絲通過黃櫨根系表面的傷口侵入維管束，然后產生分生孢子沿維管束隨蒸騰流向上擴展。大麗輪枝菌在寄主體內擴展緩慢、潛伏期長，當葉片出現明顯萎蔫癥狀時，其根部及莖干內已經存在大量病原菌，使其易錯過最佳防治期，造成病害大面積暴發。

針對黃櫨枯萎病的檢測方法主要包括病原物分離、鑒定。但傳統的病原物分離、鑒定方法費時費力，在檢測時間和操作水平上都存在較大的不足，難以對大量苗木進行快速檢測。因此，建立快速、高靈敏度的黃櫨枯萎病菌檢測技術對黃櫨枯萎病的防治具有重要意義。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種用于檢測大麗輪枝菌的引物組合、試劑盒及應用。本發明提供的引物組合能快速檢測目標基因，靈敏度高，特異性強，對大麗輪枝菌感染導致的黃櫨枯萎病防治具有重要意義。

本發明提供了一種用于檢測大麗輪枝菌的引物組合，所述引物組合包括RPA引物對和crRNA；所述RPA引物對的靶標基因包括大麗輪枝菌ITS基因；所述crRNA的靶標基因包括大麗輪枝菌ITS基因。

優選地，所述RPA引物對包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列包括Seq_1、Seq_2、Seq_3和Seq_4中的一種；所述下游引物的序列包括Seq_5、Seq_6、Seq_7和Seq_8中的一種。

優選地，所述上游引物的序列包括Seq_1；所述下游引物的序列包括Seq_6。

優選地，所述crRNA包括框架核酸片段序列和向導序列；所述向導序列包括Seq_14、Seq_15和Seq_16中的一種。

優選地，所述框架核酸片段序列包括Seq_13；所述向導序列包括Seq_15。

優選地，所述RPA引物對包括Seq_1和Seq_6；所述crRNA包括框架核酸片段序列Seq_13和向導序列Seq_15。

本發明提供了一種用于檢測大麗輪枝菌的試劑盒，包括所述引物組合，還包括DEPC水、LwaCas13a緩沖液、LwaCas13a蛋白、NTP?buffer?mix、T7?RNA?polymerase?mix、RNase?inhibitor、RNA?Reporter和大麗輪枝菌質粒標準品。

本發明還提供了所述引物組合或者所述試劑盒在檢測大麗輪枝菌中的應用。