[發明專利]離體條件下向百合鱗莖引入熒光染料的方法

在審

• 申請號: 202211202219.0
• 申請日: 2022-09-29
• 公開（公告）號: CN115541350A
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發明（設計）人: 徐蘊晨;吳昀;夏宜平;高聰;呂群丹;洪碧偉;閔芮涵
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/28;G01N21/64
• 代理公司: 杭州合信專利代理事務所(普通合伙) 33337
• 代理人: 沈自軍

本發明提供了一種離體條件下向百合鱗莖引入熒光染料的方法及研究離體百合植株同化運輸方向和路徑的熒光示蹤方法。所述離體條件下向百合鱗莖引入熒光染料的方法包括：步驟S10、以在誘芽培養基中經代謝培養的離體百合鱗莖的外層鱗片為待處理鱗片，無菌條件下，在所述待處理鱗片的遠軸端中部設置楔形切口，所述楔形切口貫穿維管束；步驟S20、在所述楔形切口內塞入吸水材料，向所述吸水材料注入熒光染料；步驟S30、注入結束后，對所述楔形切口進行封閉和避光處理。本發明中熒光染料的引入不需要專門的設備和裝置，可快速、有效地使離體百合鱗莖獲得理想的標記結果。

技術領域

本發明涉及植物細胞生理學研究技術領域，特別是涉及離體條件下向百合鱗莖引入熒光染料的方法。

背景技術

百合(Lilium spp.)被譽為球根花卉之王，是全球切花生產和綠化美化的首要球根花卉之一。百合具球形鱗莖，膨大的鱗片貯藏著豐富的營養物質，具備較高的藥用和食用價值，且鱗莖大小與百合開花的品質密切相關，因此百合鱗莖有著極大的研究和開發價值。

光合同化物運輸是決定作物產量和品質的重要因素之一。“源”通常指植物體內能產生碳水化合物的光合組織；“庫”主要為碳水化合物的積累和使用組織。高等植物中，物質運輸主要在維管束中進行，其中，韌皮部是負責同化物運輸的主要組織。韌皮部同化物運輸過程存在兩條途徑：共質體途徑(symplast pathway)和質外體途徑(apoplasticpathway)，前者通過胞間連絲進行，后者則通過跨膜運動進行，需要特定的載體以及能量的驅動。

百合鱗莖中物質的積累以淀粉和蔗糖為主，作為典型的“源-庫”復合體，在生長發育過程中經歷多次“源-庫”角色轉換，轉換過程中碳水化合物的代謝對于植物生長及開花品質具有重要作用。離體條件下，小鱗莖則主要作為庫器官，培養基中的蔗糖是百合小鱗莖發生和發育主要的“源”，其作為百合中主要運輸態碳水化合物經韌皮部運輸進入小鱗莖供生長所需或者轉化為淀粉貯藏在鱗片中促使小鱗莖增大。蔗糖不僅是百合鱗莖主要成分(淀粉)的重要前體物質，而且可作為信號分子參與調節鱗莖發生發育過程相關基因的表達、鱗莖“源-庫”角色的轉換以及整個植物“源-庫”活性的高低。因此探明百合小鱗莖形成過程中同化物運輸方向及路徑有助于了解鱗莖內糖的積累和轉化方式，對于生產優質百合鱗莖和切花具有重要的理論意義和實踐價值。

5(6)羧基熒光素酯(CFDA)是一種比較理想的共質體標記物。其原理如下：CFDA在進入細胞后被分解為膜不透過性的熒光染料5(6)羧基熒光素(CF)，只能通過胞間連絲等共質體途徑在細胞和組織間進行轉運。通過熒光顯微鏡觀察CF在庫器官內的分布情況，就能了解韌皮部同化物運輸的途徑。

關于百合鱗莖同化物運輸途徑的研究主要集中在活體百合上，而離體條件下的相關研究則較少。相比于活體條件，離體體系對于培養條件的可控性更強，且可以確保植物材料基因型的一致。此外，與活體條件下百合鱗莖“庫-源”角色的多次轉換相比，離體條件下百合小鱗莖承擔的角色更為明確——主要作為庫器官存在，因此離體體系能夠為百合鱗莖同化物運輸途徑的研究提供更為科學嚴謹的條件。

然而，離體體系下百合小鱗莖中熒光示蹤劑的引入要求無菌的實驗環境，且對實驗操作的要求更高，例如在CFDA標記過程中，其他作物上采用的電流注射法和壓力注射法需要專門的設備且技術要求高，而Eppendorf管棉線漸滲法和葉片涂抹法雖然不需要專門的設備，但操作過程繁瑣、容易損傷植株內部結構，且熒光染料溶液蒸發，均難以達到理想的標記效果。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種離體條件下向百合小鱗莖中引入熒光染料的方法，操作簡便，示蹤效果理想，具有重要的實踐應用價值。

本發明提供的離體條件下向百合鱗莖引入熒光染料的方法，包括：

步驟S10、以在誘芽培養基中經代謝培養的離體百合鱗莖的外層鱗片為待處理鱗片，無菌條件下，在所述待處理鱗片的遠軸端中部設置楔形切口(參見圖1)，所述楔形切口貫穿維管束；