[發明專利]一種活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法及其應用

在審

• 申請號: 202211187614.6
• 申請日: 2022-09-28
• 公開（公告）號: CN116024207A
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 姚韓韓;董迎輝;趙家熙;何琳;何京;呂麗媛;孫長森;林志華
• 申請（專利權）人: 浙江萬里學院;浙江萬里學院寧海海洋生物種業研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 寧波甬致專利代理有限公司 33228
• 代理人: 李迎春

本發明提供了一種活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，包括S1：殼皮采集、S2：殼皮清洗、S3：DNA提取：取殼皮組織置于研缽中，加入液氮研磨至粉狀，轉移至離心管中；加入STE裂解緩沖液，再加入SDS溶液和蛋白酶K，充分混勻，置于恒溫水浴鍋中消化過夜，直至裂解液澄清；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻、抽提后多次離心處理，取上清液，加入NaAc，無水乙醇，緩慢搖勻，置于?20℃冰箱中以進行沉淀；離心后得到DNA沉淀；棄去上清，用乙醇溶液洗滌所述步驟S33得到的沉淀；之后離心并棄去上清液，將得到的DNA沉淀在通風櫥中進行干燥處理溶解后得到所述DNA。本發明提供了一種操作便捷處理簡單的貝類高質量DNA提取方法，具有較高的商業化價值與推廣價值。

技術領域

本發明涉及貝類DNA提取技術領域，具體而言，涉及一種活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法及其應用。

背景技術

DNA作為遺傳信息的載體和最基本的遺傳物質，在遺傳變異、分子調控等方面發揮著重要作用，是分子生物學和基因工程研究的主要對象。隨著分子生物學技術的發展，群體遺傳學和分子標記輔助育種技術已廣泛應用到重要經濟貝類遺傳育種研究中，而提取高質量的DNA是進行貝類分子遺傳學研究的前提。然而，貝類DNA的提取一般需要鮮活組織樣品，即需將貝類活體打開貝殼、殼上鉆孔甚至殺死個體等取其部分軟體部組織用于DNA提取，該方法對個體損害極大，往往造成較強的機械損傷或致死，不利于貝類種質資源保存、遺傳育種，尤其是對珍稀貝類的研究工作。在貝類中，關于非致死取樣進行DNA提取已有相關報道。

包振民等公布了發明專利(CN103320425A，2013.09.25)“一種用于大規模、高通量基因分型的貝類DNA快速提取方法”，通過取用少量鰓絲組織進行DNA提取，對貝類生存、生長、發育等影響很小，建立了一種適用于大量或珍貴樣本的快速有效非致死性的DNA提取方法。董志國等公布了發明專利(CN110592071A，2019.12.20)“一種從貝類排泄物中提取貝類DNA的方法”，通過收集貝類排泄物進行DNA提取，建立了一種對貝類無刺激無損傷的技術方法，利于貝類后期保種、遺傳育種及種質資源保護，尤其對瀕危珍稀貝類。《中國海洋大學學報》2020年7月，第50卷增刊I，張鳳梅等所著“雙殼類軟體動物貝殼DNA高效提取及方法學評價”，通過對櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、長牡蠣和侏儒蛤4種貝類貝殼的DNA提取和評價實驗，提出了一種適用于雙殼類軟體動物貝殼DNA的提取方法，為活體或軟體組織取樣困難的貝類開展遺傳和進化分析提供了技術手段。

上述方法雖然各有優點，但也都存在明顯的不足，如活體開殼取鰓絲或外套膜組織，對貝類有一定刺激，且不適用于蟶類或單殼類等不能開殼的貝類；貝類排泄物提取法，存在排泄物搜集困難、提取的DNA有一定降解等問題；而貝殼中提取DNA的方法，貝殼需進行脫鈣、研磨，操作較繁瑣，而且損傷貝殼也會造成活體傷害。因此探索活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法意義重大。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，以解決目前常規方法操作困難，對活體傷害大的問題。

為解決上述問題，本發明提供了一種活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，包括以下步驟：

S1：殼皮采集：將健康無病、活力好的待檢貝類活體清洗解剖后得到條狀和/或塊狀殼皮；

S2：殼皮清洗：將所述步驟S1得到的殼皮放入離心管中，加水并進行震蕩；然后將所述殼皮轉移到另一離心管中，重復上述步驟，從而除去殼皮表面的污物、細菌；

S3：DNA提取：包括，

S31：取殼皮組織置于研缽中，加入液氮研磨至粉狀，轉移至離心管中；加入STE裂解緩沖液，再加入SDS溶液和蛋白酶K，充分混勻，置于恒溫水浴鍋中消化過夜，直至裂解液澄清；

S32：加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻、抽提后離心處理；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，混勻、抽提10min，12000rpm離心10min；