[發明專利]一種活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法及其應用

在審

• 申請號: 202211187614.6
• 申請日: 2022-09-28
• 公開（公告）號: CN116024207A
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 姚韓韓;董迎輝;趙家熙;何琳;何京;呂麗媛;孫長森;林志華
• 申請（專利權）人: 浙江萬里學院;浙江萬里學院寧海海洋生物種業研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 寧波甬致專利代理有限公司 33228
• 代理人: 李迎春

1.一種活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：殼皮采集：將健康無病、活力好的待檢貝類活體清洗解剖后得到條狀和/或塊狀殼皮；

S2：殼皮清洗：將所述步驟S1得到的殼皮放入離心管中，加水并進行震蕩；然后將所述殼皮轉移到另一離心管中，重復上述步驟，從而除去殼皮表面的污物、細菌；

S3：DNA提取：包括：

S31：取殼皮組織置于研缽中，加入液氮研磨至粉狀，轉移至離心管中；加入STE裂解緩沖液，再加入SDS溶液和蛋白酶K，充分混勻，置于恒溫水浴鍋中消化過夜，直至裂解液澄清；

S32：加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻、抽提后離心處理；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，混勻、抽提10min，12000rpm離心10min；

S33：取上清液，加入NaAc，無水乙醇，緩慢搖勻，置于-20℃冰箱中以進行沉淀；離心后得到DNA沉淀；

S34：棄去上清，用乙醇溶液洗滌所述步驟S33得到的沉淀；之后離心并棄去上清液，將得到的DNA沉淀在通風櫥中進行干燥處理，加入滅菌雙蒸水溶解DNA沉淀得到DNA溶液，完成提取。

2.根據權利要求1所述的活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于：所述步驟S34完成提取后還包括步驟S35：取步驟S4制備得到的DNA溶液進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于-20℃冰箱保存備用。

3.根據權利要求1所述的活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于：所述步驟S1中，所述清洗解剖包括：將待檢貝類活體放置于解剖盤中，用軟毛刷蘸蒸餾水充分清洗殼表的污物，用解剖刀沿著殼口平行方向輕切殼邊緣的新鮮殼皮，然后用鑷子撕下條狀和/或塊狀殼皮。

4.根據權利要求1所述的活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于：所述步驟S2中，所述震蕩為間歇震蕩，且所述震蕩的時間為1-2min。

5.根據權利要求1所述的活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于：所述步驟S31中，所述SDS溶液的濃度為10％，所述蛋白酶K的濃度為20mg/mL。

6.根據權利要求1所述的活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于：所述步驟S32中，所述混勻、抽提后離心處理包括：混勻、抽提10min后繼續以12000rpm的速度離心10min；且所述混勻、抽提后離心處理的次數為4次。

7.根據權利要求1所述的活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于：所述步驟S33中，所述離心的條件為在4℃，以13000rpm的速度離心10min。

8.根據權利要求1所述的活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于：所述步驟S34中，所述乙醇溶液的濃度為70％，所述離心的條件為：在4℃，以10000rpm的速度離心2min，且所述離心并棄去上清液的次數為2次。

9.根據權利要求1所述的活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法，其特征在于：所述步驟S34中，所述干燥處理的條件為：將DNA沉淀置于通風櫥中吹3-5min至干燥。

10.一種權利要求1-9任一項所述活體無損傷提取貝類高質量DNA的方法的應用，其特征在于：所述應用包括將所述方法應用在縊蟶毛蚶焦河藍蛤管角螺的DNA提取上。