[發明專利]一種用于發夾小RNA類藥物定量的改進型莖環引物及其定量方法

在審

• 申請號: 202211171920.0
• 申請日: 2022-09-26
• 公開（公告）號: CN115948517A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 魏波;楊華;魏崢;李波;金曉鶯;李晉鵬
• 申請（專利權）人: 蘇州藥明康德新藥開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

本發明公開了一種用于發夾小RNA類藥物定量的改進型莖環引物，該莖環引物可特異性地與發夾小RNA的中間環位置處互補配對，避免了RNA發夾結構對莖環引物與發夾小RNA配對的抑制，提高了反轉錄效率。本發明還提供了采用上述改進型莖環引物進行發夾小RNA類藥物定量的方法，該方法具有分析步驟少、成本低、效率高、準確率高的特點。

技術領域

本發明屬于寡核苷酸檢測技術領域，具體涉及一種用于發夾小RNA類藥物定量的改進型莖環引物及其定量方法。

背景技術

發夾小RNA是一種形成發夾結構的RNA序列，發夾結構可顯著增強其自身的穩定性，在導入細胞中后，可長期穩定存在，并通過RNA干擾途徑使基因沉默，在病毒感染和異常基因疾病中具有巨大的藥用潛力。目前已有許多團隊在進行發夾小RNA類藥物的研發，發夾小RNA的定量分析有利于促進此類藥物的藥代動力學和毒代動力學的研究并可用于后續的臨床檢測。

然而由于發夾小RNA本身已形成了堿基互補配對，很難針對其設計有效的雜交探針，這限制了雜交ELISA和質譜法對該類核酸藥物進行定量分析的應用。對于另一種常見的RNA定量技術，RT-qPCR，在檢測發夾小RNA時存在反轉錄效率低的問題。因為發夾小RNA自身已形成堿基配對，阻礙了常規3’端配對引物與其配對，使得反轉錄很難進行，即使反轉錄成功，也因序列太短而無法設計出有效的正向和反向引物進行RT-qPCR。另一方面，發夾小RNA結構復雜，序列長度短，使其在血漿或組織中提取困難，易造成丟失，導致定量結果不準確。

發明內容

有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明要解決的技術問題之一是提供一種用于發夾小RNA類藥物定量的改進型莖環引物，該莖環引物特異性強、通用性好，反轉錄效率高。

本發明要解決的技術問題之二是提供采用上述改進型莖環引物進行發夾小RNA類藥物定量的方法，該方法具有分析步驟少、成本低、效率高、準確率高的特點。

為解決上述第一個技術問題，本發明采用如下技術方案：一種用于發夾小RNA類藥物定量的改進型莖環引物，其具有6～9個未形成發夾結構的游離簡并堿基(A/C/G/T)，6～9個所述游離簡并堿基的具體序列以與目標發夾小RNA的中間環位置處形成互補配對為目的來設計，且所述改進型莖環引物的第一個3’端配對堿基距目標發夾小RNA?5’端大于18個堿基。

在一些實施方案中，所述改進型莖環引物的5’端是由如SEQ?ID?NO：1所示的堿基序列構成的莖環結構，3’端具有6～9個所述游離簡并堿基(A/C/G/T)。

圖1是其中一種所述改進型莖環引物的結構圖，該改進型莖環引物的5’端堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示，3’端是由6個游離簡并堿基構成并與目標發夾小RNA的中間環位置處形成互補配對(圖2)。

本發明中的改進型莖環引物直接與發夾小RNA的中間環位置處互補配對，而非RT-qPCR方法中常見的與發夾小RNA3’端配對。

采用本發明中的改進型莖環引物可避免RNA的發夾結構對莖環引物與發夾小RNA配對的抑制，使反轉錄過程能夠順利進行。

為解決上述第二個技術問題，本發明采用如下技術方案：采用上述改進型莖環引物進行發夾小RNA類藥物定量的方法，包括如下步驟：采用所述改進型莖環引物對血漿或組織裂解液中的發夾小RNA進行反轉錄，獲得目標cDNA，然后采用RT-qPCR引物進行RT-qPCR反應，獲得所述目標發夾小RNA的定量結果。該定量方法步驟如圖2、圖3、圖4所示。

所述反轉錄反應時采用溫度梯度使所述改進型莖環引物的3’端與所述目標發夾小RNA的中間環位置處能夠通過所述游離簡并堿基進行成功配對，配對的所述簡并堿基的數量為6～9個。所述反轉錄反應時采用的溫度梯度具體為：95℃，5分鐘；80℃，2分鐘；70℃，2分鐘；60℃，2分鐘；45℃，2分鐘，最后放置冰上。