[發明專利]一種用于發夾小RNA類藥物定量的改進型莖環引物及其定量方法

在審

• 申請號: 202211171920.0
• 申請日: 2022-09-26
• 公開（公告）號: CN115948517A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 魏波;楊華;魏崢;李波;金曉鶯;李晉鵬
• 申請（專利權）人: 蘇州藥明康德新藥開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

1.一種用于發夾小RNA類藥物定量的改進型莖環引物，其特征在于，所述改進型莖環引物具有6～9個未形成發夾結構的游離簡并堿基(A/C/G/T)，6～9個所述游離簡并堿基的具體序列以與目標發夾小RNA的中間環位置處形成互補配對為目的來設計，且所述改進型莖環引物的第一個3’端配對堿基距目標發夾小RNA?5’端大于18個堿基。

2.根據權利要求1所述的改進型莖環引物，其特征在于，所述改進型莖環引物的5’端是由如SEQ?ID?NO：1所示的堿基序列構成的莖環結構，3’端具有6～9個所述游離簡并堿基(A/C/G/T)。

3.一種發夾小RNA的定量方法，其特征在于，采用權利要求1所述的改進型莖環引物進行檢測。

4.根據權利要求3所述的定量方法，其特征在于，包括以下步驟：采用所述改進型莖環引物對血漿或組織裂解液中的發夾小RNA進行反轉錄，獲得目標cDNA，然后采用RT-qPCR引物進行RT-qPCR反應，獲得所述目標發夾小RNA的定量結果。

5.根據權利要求4所述的定量方法，其特征在于，反轉錄反應時采用溫度梯度使所述改進型莖環引物的3’端與所述目標發夾小RNA的中間環位置處能夠通過所述簡并堿基進行成功配對，配對的所述簡并堿基的數量為6～9個。

6.根據權利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述溫度梯度具體為：95℃，5分鐘；80℃，2分鐘；70℃，2分鐘；60℃，2分鐘；45℃，2分鐘，最后放置冰上。

7.根據權利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述RT-qPCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物含有4～6個隨機堿基和12～16個與所述目標發夾小RNA?5’端相同的堿基，所述反向引物的堿基序列如SEQ?ID?NO：2所示。

8.根據權利要求7所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的隨機堿基序列的確定以調節引物的Tm值和GC含量為目的，使得Tm值為60±2℃，GC含量為40％～60％；所述正向引物與所述目標發夾小RNA互補的堿基序列為14個。

9.根據權利要求4所述的定量方法，其特征在于，在RT-qPCR反應中以SYBR?Green?I作為染料進行定量檢測。

10.根據權利要求4所述的定量方法，其特征在于，可直接使用血漿或組織裂解液作為模板進行反轉錄和RT-qPCR反應，不需要進行核酸的提取。