[發明專利]一種高表達和高活性纖連蛋白突變體及其應用

有效

• 申請號: 202211139871.2
• 申請日: 2022-09-19
• 公開（公告）號: CN116063459B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 熊盛;劉啟偉;陳偉;謝心善;謝秋玲;彭燕輝;王一婷
• 申請（專利權）人: 暨南大學;廣州啟點生物科技有限公司;彭氏（惠州）實業發展有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/12;C12N15/70;C12N5/00;A61K38/39;A61P43/00;A61P7/04;A61P17/02
• 代理公司: 合肥匯融專利代理有限公司 34141
• 代理人: 王秀芳

本發明提供一種高表達和高活性纖連蛋白突變體及其應用，涉及生物醫藥技術領域。所述高表達和高活性纖連蛋白突變體的編碼序列如SEQ?ID?NO.1，且該纖連蛋白突變體為選取纖連蛋白與細胞粘附活性密切相關的結構域，構建纖連蛋白突變體D8910，并將纖連蛋白突變體D8910采用翻譯暫停理論設計編碼纖連蛋白的核苷酸序列，在不改變纖連蛋白氨基酸序列的情況下，將纖連蛋白密碼子中翻譯速度較快的密碼子替換成翻譯速度較慢的密碼子，制造翻譯暫停位點來優化獲得。本發明克服了現有技術的不足，由此纖連蛋白突變體建重組載體、表達、純化得到的重組纖連蛋白，能夠有效促進細胞增殖活性和粘附活性。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種高表達和高活性纖連蛋白突變體及其應用。

背景技術

纖連蛋白是一種細胞外基質(ECM)的粘附分子，其廣泛存在于血液、體液及各類組織中的高分子糖蛋白。分子量為450kda，由兩個220kda的亞基通過二硫鍵連接形成。亞基有6個致密球狀體構成，每個區域都有特定的功能可以與特殊的配體結合，具有多種生物學功能。FN中至少存在兩個獨立于細胞附著的區域，其一是在FN中心位置，具有兩個協同作用的氨基酸序列ARG-GLY-ASP(RGD)和PRO-HIS-ARG-ASN(PHRSN)，另一個在羧基端附近，IIICS交替拼接，關鍵小序列是LEU-ASP-VAL(LDV)和ARG-GLU-ASP-VAL(REDV)。RGD是α5β1、αvβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α8β1整合素的常見結合位點。有研究表明，當細胞同時存在αVβ1與α5β1時，才能夠促進細胞增殖。FN基因位于2號染色體上75kb左右，擁有50個左右的外顯子，基因序列的90％以上都是通過FNI型II型III型重復排列組成。它的主要結構和排列方式從(N-C)端依次為：①6個FNI、②2個FNII、③3個FNI、④14個FNIII、⑤V區(IIICS區)、⑥1個FNIII和⑦3個FNI。

纖連蛋白是細胞外基質的重要組成部分，通過與細胞表面受體及細胞外基質分子的相互作用，促進細胞粘附、遷移，促進創傷修復，因此，纖連蛋白在醫學、美容、護膚領域有廣泛的應用前景。雖然動物組織、血液中含有纖連蛋白，但是含量極為有限，因此，組織來源的纖連蛋白存在產量低，成本高，產品純度低的缺點。重組DNA技術通過構建線路蛋白基因的表達載體，在原核或者真核生物中表達、制備高純度的纖連蛋白。纖連蛋白單體約220～250KDa，分子量較大，研究表明，通過選擇纖連蛋白上的部分結構域，重組DNA技術制備含有纖連蛋白部分結構域的突變體，具有纖連蛋白的生物學活性。但是，如何篩選纖連蛋白的活性結構域進行重構，獲得高活性、高穩定性的纖連蛋白突變體是制約纖連蛋白應用的關鍵技術之一。此外，重組蛋白異源表達時，往往表達量低，或者以包涵體形式表達，這也是制約纖連蛋白應用的另一關鍵技術。

且最新的研究表明：不同的DNA雖然可以翻譯成同樣的氨基酸，蛋白質生成的速度(翻譯速度)并非恒定，在某些區段上會比較緩慢，這種現象稱為翻譯暫停(translationalpausing或translational?attenuation)翻譯暫停位點與蛋白質折疊高度相關，若翻譯暫停位點不正確，該慢的地方快了，或者該快的地方慢了，都將導致蛋白質錯誤折疊聚集，無法得到有功能的可溶性蛋白。

發明內容

針對現有技術不足，本發明提供一種高表達和高活性纖連蛋白突變體。

為實現以上目的，本發明的技術方案通過以下技術方案予以實現：

一種高表達和高活性纖連蛋白突變體，所述高表達和高活性纖連蛋白突變體為優化后的纖連蛋白突變體D8910，所述纖連蛋白突變體D8910為選取纖連蛋白與細胞粘附活性密切相關的結構域，構建得到。

優選的，所述優化的纖連蛋白突變體D8910的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1。

優選的，所述優化的方式為通過翻譯暫停理論對纖連蛋白突變體D8910的核苷酸序列進行優化。