[發明專利]一種絲狀真菌氧化還原指示傳感器及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202211121153.2
• 申請日: 2022-09-15
• 公開（公告）號: CN116286403A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 沈其榮;劉東陽;朱瀚;李馳;李托;劉洋
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/12;C12N15/31;C12N15/65;G01N21/64;C12R1/885
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 吳爽;徐冬濤

本發明公開了一種絲狀真菌氧化還原指示傳感器及其構建方法和應用。本發明所涉及的傳感器，以avGFP為原型，通過定點突變氨基酸位點并在avGFP的149和202位引入一對半胱氨酸最終形成相應序列；以哈茨木霉NJAU?4742的基因組DNA為模板，克隆長度為1308?bp的U3基因片段，基因合成潮霉素B抗性表達片段，以哈茨木霉NJAU?4742的基因組DNA為模板，克隆長度為532bp的U3基因上游同源臂，克隆長度為1663bp的強啟動子片段，以pUC57質粒為模板擴增的氧化還原指示傳感器功能性片段以及長度為1185bp的U3基因下游同源臂，并將6個片段利用融合PCR技術進行融合，再通過轉化的方式最終形成氧化還原指示熒光菌株。本發明的傳感器，將為實現絲狀真菌胞內氧化還原狀態的可視化操作提供理論和應用基礎。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種絲狀真菌氧化還原指示傳感器及其構建方法和應用。

背景技術

氧化還原狀態是評估細胞生理和病理狀態的重要指標。在正常情況下，細胞內的氧化還原反應維持在一個平衡狀態，隨著外界條件的變化或細胞自身的代謝失衡，細胞內的氧化還原狀態會發生改變，細胞內活性氧(ROS)大量累積，造成DNA、蛋白質損傷以及脂質過氧化等，影響細胞結構和功能，嚴重情況下會造成細胞凋亡。哈茨木霉菌NJAU?4742(Trichoderma?guizhouense?NJAU?4742，以下簡稱NJAU?4742)是一種在自然界中分布較廣的根際有益絲狀真菌。因其自身對植物生長具有明顯的促生作用、對土傳病原菌具有有效的拮抗作用以及對木質纖維素的高效降解作用而被廣泛應用于各類研究。NJAU?4742定殖于植物根部后能與植物形成共生體，顯著促進根際養分的轉化并通過分泌次級代謝產物和植物生長調節劑來促進植物的生長，有效地施用NJAU?4742菌株及其相關的生物有機肥產品，也是減少我國農用化學品投入的重要途徑之一。

研究表明，熱應激、鹽脅迫、營養脅迫等不同的壓力應激會引發真菌細胞內氧化還原狀態的失衡，導致細胞內活性氧(ROS)大量積累，進而影響細胞的正常功能?；谄浒麅妊趸€原狀態對于木霉發揮功能的重要性，因此相關參數的測定是一個重要的判斷依據。目前可以較好反映胞內氧化還原平衡的谷胱甘肽庫由還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)組成，它們各自的比例可以由谷胱甘肽還原酶調節，谷胱甘肽還原酶將GSSG還原為GSH，其中還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)組成的GSH/GSSG途徑是植物體內重要的抗性系統之一，在信號傳導和抗逆方面發揮重要作用。雖然目前可以通過測定胞內GSSG/GSH比值來衡量胞內氧化還原狀態變化，但是絲狀真菌胞內氧化還原狀態的可視化觀測方法目前尚不明確。因此實現胞內氧化還原狀態變化的可視化極為重要。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，本發明的第一個目的提供一種絲狀真菌氧化還原指示傳感器；

本發明的第二個目的是提供一種絲狀真菌氧化還原指示傳感器的構建方法；

本發明的第三個目的是提供前述傳感器的應用。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

第一方面，本發明保護一種絲狀真菌氧化還原指示傳感器，通過將avGFP蛋白的氨基酸序列的第69位氨基酸由丙氨酸突變成谷氨酰胺，第150位氨基酸由纈氨酸突變成天冬氨酸，并在avGFP的149和202位引入一對半胱氨酸得到。

優選的，所述絲狀真菌為哈茨木霉NJAU?4742。

本發明還保護前文所述的氧化還原狀態動態監測的功能性片段的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。