[發明專利]一種線蟲試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 202211111649.1
• 申請日: 2022-09-13
• 公開（公告）號: CN115669613A
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 張鈴玉;黃逸瀅;李健;吳達仁
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;G01N21/84
• 代理公司: 廈門創象知識產權代理有限公司 35232
• 代理人: 王鳳玲;尤懷成

1.一種線蟲試劑盒，其特征在于，包括：96孔板、試劑A和試劑B；

所述96孔板中的每個孔含有LB-膽固醇培養基和秀麗隱桿線蟲幼蟲；所述秀麗隱桿線蟲幼蟲為經同步化后饑餓狀態的dauer期線蟲；

所述試劑A為大腸桿菌OP50；

所述試劑B為5-氟脲嘧啶。

2.如權利要求1所述的線蟲試劑盒，其特征在于，經同步化后饑餓狀態的dauer期線蟲的制備包括以下步驟：

使用M9緩沖溶液將正處于產卵期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲從NGM培養基平板上多次沖洗下至50mL離心管中，靜止數分鐘，待線蟲下沉至管底，棄去上清；

將線蟲液定容至30mL于50mL離心管內，按照線蟲液和裂解液2：1的比例，向管中加入裂解液15mL，上下顛倒混合，反應5min后，9000rpm離心3min，棄去上清，收集沉淀；

沉淀使用M9緩沖液進行上下混勻，以9000rpm離心3min，重復3次，獲得含有蟲卵的溶液；

將含有蟲卵的溶液于25℃的生化培養箱內培養12h，再將培養后的沉淀轉到新的培養基平板中培養，不需要添加大腸桿菌OP50，20℃培養12h孵化幼蟲L1期；

蟲卵孵化后不再提供食物，3～4天后線蟲進入到饑餓狀態，即dauer期線蟲幼蟲。

3.如權利要求2所述的線蟲試劑盒，其特征在于，將dauer期線蟲幼蟲吸取至離心管中，使用無菌水進行稀釋至線蟲懸液的濃度為3500～4000條/mL，再取線蟲懸液至96孔板的各孔中，使得每個孔具有70～80條線蟲。

4.權利要求1-3中任一項所述的線蟲試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將待測藥物溶解于試劑A中，作為食物喂養96孔板中的秀麗隱桿線蟲幼蟲，空白組使用等量無菌水替換待測藥物；

(2)秀麗隱桿線蟲幼蟲從同期化長成L4期計為0d，96孔板在25℃培養箱內恒溫培養，每日用體顯微鏡觀察，并記錄秀麗隱桿線蟲存活、死亡的數目；

(3)以10天為一個周期補加4μL濃度為12.5mg/mL的試劑B，不定期補充菌液和無菌水至壽命周期結束；

(4)當用體顯微鏡觀察到身體僵直，不動的線蟲時，線蟲被記為死亡；爬到培養皿邊緣或皿蓋干死、鉆到瓊脂里面的秀麗隱桿線蟲從實驗中排除；

(5)采用相關軟件對實驗數據進行處理、分析，計算出秀麗隱桿線蟲的平均壽命，平均壽命顯著高于空白組則證明待測藥物具有抗衰老活性，平均壽命低于或等于空白組則證明待測藥物不具有抗衰老活性。