[發(fā)明專利]一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211100729.7
• 申請(qǐng)日: 2022-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN116144578A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭立;趙勁民;許勝;蔡捷;馬珂;羅艷;周波;曾韜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/07
• 分類號(hào): C12N5/07;A61K35/618;A61P17/02
• 代理公司: 蘇州科洲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32435
• 代理人: 李奎鋒

本發(fā)明公開了一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法，包括如下步驟：S1：采集珍珠貝，用清水沖洗天然貝母外殼減少體表附著雜質(zhì)，去除外殼泥沙海藻；S2：開貝取出貝肉和粘液，用紗布過(guò)濾分離貝肉和粘液獲得初分離黏液；S3：對(duì)初分離黏液添加青霉素和鏈霉素溶液以抑制海洋環(huán)境中含有的細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖影響?zhàn)ひ和饷隗w質(zhì)量；S4：對(duì)初分離黏液液梯度離心得到預(yù)處理黏液；S5：采用免疫磁珠法從珍珠貝黏液中分離得到囊泡狀納米顆粒，即得產(chǎn)物。該提取方法具有成本低、來(lái)源廣、操作簡(jiǎn)單、且馬氏珠母貝可循環(huán)獲取體表黏液的效果；所獲得外泌體能促進(jìn)人成纖維細(xì)胞增殖，能夠應(yīng)用于促進(jìn)皮膚傷口愈合。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種從珍珠貝體表黏液制備外泌體的提取方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

外泌體和細(xì)胞外囊泡是由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物因子組成的球形納米顆粒，目前國(guó)際上對(duì)于細(xì)胞外囊泡和外泌體并沒(méi)有明確的分類，通常情況下，將他們稱為囊泡狀納米顆粒。作為一種細(xì)胞分泌的囊泡狀納米顆粒，外泌體可以在細(xì)胞之間傳遞物質(zhì)信息，因此外泌體已被應(yīng)用于多種疾病的治療，如抗腫瘤、抗炎癥及抗氧化等。由于外泌體是細(xì)胞產(chǎn)物，因此，與其他治療方法相比，使用外泌體作為治療方法具有更低的細(xì)胞毒性和更高的生物相容性。免疫磁珠分離技術(shù)是一項(xiàng)基于抗原一抗體結(jié)合作用發(fā)展起來(lái)的免疫學(xué)技術(shù)。它主要是靠在磁珠表面修飾氨基、羧基、鏈霉親和素等基團(tuán)，利用這些基團(tuán)可以和抗體共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)，可用于結(jié)合相應(yīng)的抗原，在外加磁場(chǎng)的作用下可達(dá)到相應(yīng)抗原物質(zhì)的分離，廣泛應(yīng)用于核酸提取和膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)分離如細(xì)胞分離領(lǐng)域。外泌體分布在許多生物體的體液和細(xì)胞中，但大多數(shù)外泌體的分離來(lái)源主體仍然是人類細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞。然而，人源細(xì)胞外泌體存在許多局限性，如分離產(chǎn)量低和分離成本高。因此，尋找新的外泌體來(lái)源來(lái)取代人類細(xì)胞來(lái)源外泌體顯得尤為重要。

有研究發(fā)現(xiàn)外泌體已從牡蠣中分離出來(lái)，并經(jīng)過(guò)鑒定，它們具有相關(guān)促進(jìn)傷口修復(fù)特性，而在海洋生物中，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)從海參中分離出具有類似促進(jìn)傷口修復(fù)作用的細(xì)胞外囊泡。如專利CN114480249A公開了一種馬氏珠母貝黏液用于提取外泌體的用途、外泌體及其提取方法和應(yīng)用，采用超速離心法從馬氏珠母貝黏液中分離得到囊泡狀納米顆粒，并鑒定為外泌體，由此為從海洋生物中提取生物活性外泌體提供了參考，同時(shí)也提高了馬氏珠母貝的利用價(jià)值，該專利從馬氏珠母貝黏液中提取的外泌體能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制NF-κB和NLRP3通路的激活，降低相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)水平，具有一定的抗炎作用，但上述專利的研究還存在一定的局限、不夠深入。此外，有研究成功從鱈魚黏液中分離和提取出外泌體，并發(fā)現(xiàn)它們含有免疫相關(guān)蛋白。然而，與人類和植物來(lái)源的外泌體相比，從海洋生物中提取外泌體的研究仍相對(duì)缺乏。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問(wèn)題是從海洋生物珍珠貝中提取一種新型的外泌體，并研究該外泌體的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法，包括如下步驟：

S1：采集珍珠貝，用清水沖洗天然貝母外殼減少體表附著雜質(zhì)，去除外殼泥沙海藻；

S2：開貝取出貝肉和粘液，用紗布過(guò)濾分離貝肉和粘液獲得初提取黏液；

S3：對(duì)初分離黏液添加青霉素和鏈霉素以抑制海洋環(huán)境中含有的細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖影響?zhàn)ひ和饷隗w質(zhì)量；

S4：對(duì)初分離黏液液梯度離心得到預(yù)處理黏液；

S5：通過(guò)外泌體分離免疫磁珠法從珍珠貝黏液中分離得到囊泡狀納米顆粒，即得產(chǎn)物。

優(yōu)選的，在步驟S3中添加的青霉素和鏈霉素溶液的最終濃度為1％。

優(yōu)選的，所述步驟S4中對(duì)初分離黏液進(jìn)行三次液梯度離心，第一次離心處理的離心力為300g，離心時(shí)間為10min，取上清；第二次離心處理的離心力為2000g，離心時(shí)間為10min，取上清；第三次離心處理的離心力為10000g，離心時(shí)間為30min，取上清。