[發明專利]一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法

在審

• 申請號: 202211100729.7
• 申請日: 2022-09-09
• 公開（公告）號: CN116144578A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 鄭立;趙勁民;許勝;蔡捷;馬珂;羅艷;周波;曾韜
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;A61K35/618;A61P17/02
• 代理公司: 蘇州科洲知識產權代理事務所(普通合伙) 32435
• 代理人: 李奎鋒

1.一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：采集珍珠貝，用清水沖洗天然貝母外殼減少體表附著雜質，去除外殼泥沙海藻；

S2：開貝取出貝肉和粘液，用紗布過濾分離貝肉和粘液獲得初分離黏液；

S3：對初分離黏液添加青霉素和鏈霉素以抑制海洋環境中含有的細菌生長繁殖影響黏液外泌體質量；

S4：對初分離黏液液梯度離心得到預處理黏液；

S5：采用免疫磁珠法從珍珠貝黏液中分離得到囊泡狀納米顆粒，即得產物。

2.根據權利要求1所述的一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法，其特征在于，在步驟S3中添加的青霉素和鏈霉素溶液的最終濃度為1％。

3.根據權利要求1所述的一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法，其特征在于，所述步驟S4中對初分離黏液三次液梯度離心；

第一次離心處理的離心力為300g，離心時間為10min，取上清；

第一次離心處理的離心力為2000g，離心時間為10min，取上清；

第一次離心處理的離心力為10000g，離心時間為30min，取上清。

4.根據權利要求1所述的一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法，其特征在于，所述外泌體分離采用CD9和CD63抗體包被的免疫磁珠法。

5.根據權利要求4所述的一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法，其特征在于，所述步驟S5中的處理過程基于CD63和CD9抗體偶聯磁珠從珍珠貝黏液中分離得到囊泡狀納米顆粒，具體步驟包括：

S501、用磁珠表面功能化處理修飾CD63和CD9抗體，漩渦震蕩鏈霉親和素修飾磁珠，取磁珠懸液用分離緩沖液清洗磁力架分離磁珠，清洗完成后用分離緩沖液懸浮，然后向所得懸浮液中加入CD63、CD9單克隆抗體，顛倒旋轉孵育；孵育完成后用分離緩沖液清洗，磁力架分離磁珠，再用分離緩沖液懸浮，即得到表面修飾有CD63和CD9抗體的功能化磁珠；

S502、過濾待測珍珠貝黏液上清液樣本，加入過濾后的珍珠貝黏液上清液樣本與CD63和CD9抗體偶聯磁珠懸浮液，孵育完成后用磷酸緩沖鹽溶液清洗磁力架分離磁珠，即得到磁珠-抗體-外泌體復合物；

S503、用胰蛋白酶洗滌磁吸附物，并將洗滌后的磁吸附物與洗脫緩沖液混合并孵育，使固液分離，收集外泌體提取液，重懸保存。

6.根據權利要求5所述的一種從珍珠貝體表黏液提取外泌體的方法，其特征在于，在步驟S503中，將收集外泌體提取液重懸保存到-80℃。

7.一種外泌體，其特征在于，采用如權利要求1-6任一項所述的外泌體提取方法所制備而成。

8.根據權利要求7所述的外泌體在制備促進皮膚創傷愈合的藥物或器械中的應用。