[發(fā)明專利]一種小鼠聽覺神經(jīng)元永生細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211098985.7
• 申請日: 2022-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN115369095A
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉聞聞;王嫚;王海波;王雪
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省第二人民醫(yī)院（山東省耳鼻喉醫(yī)院;山東省耳鼻喉研究所）
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 山東祺智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37361
• 代理人: 王增娣

本發(fā)明涉及永生化細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小鼠聽覺神經(jīng)元永生細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過分離小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞后，利用SV40LT過表達(dá)慢病毒載體（EF1α?SV40?IRES?puromycin載體元件）轉(zhuǎn)染螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，獲得與原代小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性狀無明顯差別的小鼠聽覺神經(jīng)元永生細(xì)胞系SIO?SGN1，該永生細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代，實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的離體培養(yǎng)和傳代，為聽覺研究提供便利條件。且該永生細(xì)胞系體外培養(yǎng)條件簡單，傳代速度快，是可以穩(wěn)定用于聽覺研究的細(xì)胞工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及永生化細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小鼠聽覺神經(jīng)元永生細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

耳聾已成為全球性的重大公共衛(wèi)生問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球約有15億人患有不同程度的耳聾障礙，占世界總?cè)丝诘?9。耳聾障礙對于耳聾患者家庭、社會(huì)以及耳聾患者自身都造成了嚴(yán)重影響。耳聾發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，且易受環(huán)境、藥物、年齡等多種因素的影響，因此對于耳聾發(fā)生的機(jī)制及預(yù)防和治療方法的研究仍需進(jìn)一步深入。

作為內(nèi)耳中的聽覺神經(jīng)元，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是聽覺傳導(dǎo)通路上的第一級(jí)神經(jīng)元，能夠?qū)碜悦?xì)胞的聲音信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)并向上傳導(dǎo)到大腦聽覺中樞，從而形成聽覺。因此，螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在聽覺傳導(dǎo)過程中起著十分重要的作用，也是現(xiàn)在聽覺研究的重點(diǎn)對象。然而，由于內(nèi)耳當(dāng)中細(xì)胞類型眾多，普通的分離培養(yǎng)方法難以獲得純化的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并且螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元屬于終末分化細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過程中難以傳代，且在體外培養(yǎng)時(shí)對于培養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格、存活時(shí)間有限，如文獻(xiàn)Wei, D., et al., Survival,synaptogenesis, and regeneration of adult mouse spiral ganglion neuronsinvitro. Journal of Neurobiology, 2007. 67（1）: p. 108-122和Yan, W., et al., AThree-Dimensional Culture System with Matrigel Promotes Purified SpiralGanglion Neuron Survival and Function In Vitro. Mol Neurobiol, 2018. 55（3）:p. 2070-2084，因此限制了其在內(nèi)耳研究中的應(yīng)用。需要采用永生化技術(shù)建立永生化的小鼠聽覺神經(jīng)元細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)問題，發(fā)明人通過對永生化小鼠內(nèi)耳聽神經(jīng)元進(jìn)行了研究，分離小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞后，利用含有EF1α-SV40-IRES-puromycin載體元件的SV40LT過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染螺旋神經(jīng)節(jié)，并篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，獲得與原代小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性狀無明顯差別的小鼠聽覺神經(jīng)元永生細(xì)胞系SIO-SGN1，該永生細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代，實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的離體培養(yǎng)和傳代，為聽覺研究提供便利條件。且該永生細(xì)胞系體外培養(yǎng)條件簡單，傳代速度快，是可以穩(wěn)定用于聽覺研究的細(xì)胞工具。

首先，本發(fā)明所述的小鼠聽覺神經(jīng)元永生細(xì)胞系，其保藏編號(hào)為CCTCC NO：C202275。

本發(fā)明所述的小鼠聽覺神經(jīng)元永生細(xì)胞系，通過如下方法構(gòu)建獲得，具體過程為：

（1）C57小鼠聽覺神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)：將出生1d的C57小鼠取耳蝸解剖蝸軸并酶解消化，重懸單細(xì)胞后鋪瓶培養(yǎng)；

（2）對分離細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定：細(xì)胞爬片后進(jìn)行免疫熒光染色，觀察神經(jīng)元標(biāo)記物的染色情況；

（3）采用SV40LT過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染C57小鼠聽神經(jīng)元細(xì)胞：利用SV40LT過表達(dá)慢病毒載體（EF1α-SV40-IRES-puromycin載體元件）轉(zhuǎn)染螺旋神經(jīng)節(jié)。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞擴(kuò)增3-4代后進(jìn)行篩選；

（4）C57小鼠聽神經(jīng)元細(xì)胞的篩選：利用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。