[發明專利]堿性磷酸酶突變體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202211088891.1
• 申請日: 2022-09-07
• 公開（公告）號: CN115747189A
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 張雅潔;宮安;羅漫杰;施婧妮;徐燦;王梁
• 申請（專利權）人: 武漢瀚海新酶生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 孟潔

本發明涉及一種堿性磷酸酶突變體及其制備方法和應用。該堿性磷酸酶突變體包括：由野生型堿性磷酸酶發生如下突變中的至少一種得到的多肽，野生型堿性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，突變包括：第51位的賴氨酸被天冬酰胺替代、第113位的組氨酸被谷氨酸替代。通過將第51位的賴氨酸被天冬酰胺替代或者將第113位的組氨酸被谷氨酸替代，能減弱野生型堿性磷酸酶蛋白分子二聚體界面處的氫鍵強度，從而減弱了酶的熱穩定性，提高酶的熱敏感性。經試驗驗證，與野生型堿性磷酸酶相比，本研究的堿性磷酸酶突變體的穩定性和比活力均有大幅度提高，蛋白比酶活大于1200U/mg，65℃15min可以完全失活。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種堿性磷酸酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatases，EC 3.1.3.1)是一種廣泛存在于原核細胞和哺乳動物的酶，主要用于去除核苷酸、蛋白質和生物堿等的磷酸基團。目前已有很多種類型的堿性磷酸酶應用在生物學和醫學方面。堿性磷酸酶作為實驗室普遍使用的一種酶，常用于分子克隆中非特異性地脫磷酸基團，減弱來自空載體或重組載體的環境影響。被磷酸酶處理過的片段缺少5’的磷?；鶚酥荆虼四軌虮苊庾晕噎h化，降低合成時環境方向性的影響。大多數堿性磷酸酶均是兩個相同的亞基組成的同型二聚體，在酶的中間部分有10組β折疊的保守序列。

市售的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatases，AP)，如小牛腸堿性磷酸酶(Calfintestinal alkaline phosphatase，CIAP)和大腸桿菌堿性磷酸酶(Escherichia colialkaline phosphatase，ECAP)的熱敏感性較差，使用后難以通過加熱滅活。

發明內容

基于此，有必要提供一種熱敏感性較高的堿性磷酸酶突變體及其制備方法和應用。

一種堿性磷酸酶突變體，所述堿性磷酸酶突變體包括：由野生型堿性磷酸酶發生如下突變中的至少一種得到的多肽，所述野生型堿性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述突變包括：第51位的賴氨酸被天冬酰胺替代(即K51N)、第113位的組氨酸被谷氨酸替代(即H113E)。

氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生型堿性磷酸酶為南極細菌TAB5的一種堿性磷酸酶，研究發現，該野生型堿性磷酸酶的第51位賴氨酸和第113位組氨酸均為酶二聚體界面處的氨基酸，通過將第51位的賴氨酸被天冬酰胺替代或者將第113位的組氨酸被谷氨酸替代，能減弱野生型堿性磷酸酶蛋白分子二聚體界面處的氫鍵強度，從而減弱了酶的熱穩定性，提高酶的熱敏感性。經試驗驗證，與野生型堿性磷酸酶相比，本研究的堿性磷酸酶突變體的穩定性和比活力均有大幅度提高，蛋白比酶活大于1200U/mg，65℃15min可以完全失活。

其中一個實施例中，所述堿性磷酸酶突變體的氨基酸序列含有如SEQ ID No.3-SEQ ID No.4所示的多肽中的一種。

一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼上述堿性磷酸酶突變體。

一種重組載體，含有上述多核苷酸。

一種重組工程菌，含有上述重組載體。

一種堿性磷酸酶突變體的制備方法，包括如下步驟：擴大培養上述重組工程菌，加入誘導劑繼續培養，培養結束后固液分離，收集細胞并破碎，提取破碎后細胞中的堿性磷酸酶突變體。

其中一個實施例中，所述加入誘導劑繼續培養的步驟中，所述誘導劑為0.05mM-0.5mM的IPTG；

及/或，所述加入誘導劑繼續培養的步驟中，誘導溫度為16℃-30℃；

及/或，所述加入誘導劑繼續培養的步驟中，誘導時間為4h-16h。