[發明專利]堿性磷酸酶突變體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202211088891.1
• 申請日: 2022-09-07
• 公開（公告）號: CN115747189A
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 張雅潔;宮安;羅漫杰;施婧妮;徐燦;王梁
• 申請（專利權）人: 武漢瀚海新酶生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 孟潔

1.一種堿性磷酸酶突變體，其特征在于，所述堿性磷酸酶突變體包括：由野生型堿性磷酸酶發生如下突變中的至少一種得到的多肽，所述野生型堿性磷酸酶的氨基酸序列如SEQID No.2所示，所述突變包括：第51位的賴氨酸被天冬酰胺替代、第113位的組氨酸被谷氨酸替代。

2.根據權利要求1所述的堿性磷酸酶突變體，其特征在于，所述堿性磷酸酶突變體的氨基酸序列含有如SEQ ID No.3-SEQ ID No.4所示的多肽中的一種。

3.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼如權利要求1或2所述的堿性磷酸酶突變體。

4.一種重組載體，其特征在于，含有權利要求3所述的多核苷酸。

5.一種重組工程菌，其特征在于，含有權利要求4所述的重組載體。

6.一種堿性磷酸酶突變體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：擴大培養權利要求5所述的重組工程菌，加入誘導劑繼續培養，培養結束后固液分離，收集細胞并破碎，提取破碎后細胞中的堿性磷酸酶突變體。

7.根據權利要求6所述的堿性磷酸酶突變體的制備方法，其特征在于，所述加入誘導劑繼續培養的步驟中，所述誘導劑為0.05mM-0.5mM的IPTG；

及/或，所述加入誘導劑繼續培養的步驟中，誘導溫度為16℃-30℃；

及/或，所述加入誘導劑繼續培養的步驟中，誘導時間為4h-16h。

8.根據權利要求6所述的堿性磷酸酶突變體的制備方法，其特征在于，提取破碎后細胞中的堿性磷酸酶突變體的步驟包括：對所述破碎后的細胞進行硫酸銨分級分離，然后層析純化，得到所述堿性磷酸酶突變體。

9.根據權利要求8所述的堿性磷酸酶突變體的制備方法，其特征在于，對所述破碎后的細胞進行硫酸銨分級分離的步驟包括：

加入終濃度為0.4M的硫酸銨對所述破碎后的細胞進行處理，固液分離，收集第一上清；

加入終濃度為0.7M的硫酸銨對所述上清進行處理，固液分離，收集第二上清。

10.根據權利要求9所述的堿性磷酸酶突變體的制備方法，其特征在于，對所述第二上清進行層析純化的步驟包括：

對所述第二上清進行Ni柱親和純化，得到親和洗脫液；

對所述親和洗脫液進行陰離子交換層析純化，得到堿性磷酸酶突變體。

11.根據權利要求10所述的堿性磷酸酶突變體的制備方法，其特征在于，對所述親和洗脫液進行陰離子交換層析純化的步驟中：

采用上樣緩沖液對所述親和洗脫液進行上樣，所述上樣緩沖液包括：20mM、pH 8.0的Tris-HCl，1mM MgCl₂，0.1％(v/v)Triton X-100和10％(v/v)甘油；

采用第一洗脫緩沖液和第二洗脫緩沖液進行梯度洗脫，所述第一洗脫緩沖液包括：20mM、pH 8.0的Tris-HCl，1mM MgCl₂，0.1％(v/v)Triton X-100和10％(v/v)甘油，所述第二洗脫緩沖液包括：20mM、pH 8.0的Tris-HCl，1mMMgCl₂、0.1％(v/v)Triton X-100、1MNaCl和10％(v/v)甘油，所述梯度洗脫為10個柱體積內從100％(v/v)的所述第一洗脫緩沖液和0％(v/v)的所述第二洗脫緩沖液梯度洗脫至0％(v/v)的所述第一洗脫緩沖液和100％(v/v)的所述第二洗脫緩沖液。

12.權利要求1-2任一項所述的堿性磷酸酶突變體、權利要求3所述的多核苷酸，權利要求4所述的重組載體或者權利要求5所述的重組工程菌在制備分子克隆試劑中的應用。