[發明專利]一株生產類母乳脂肪的釀酒酵母菌株及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202211084252.8
• 申請日: 2022-09-06
• 公開（公告）號: CN116162558A
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;吳文揚;堵國成;李江華;周國霖;劉延峰;張晨陽
• 申請（專利權）人: 江南大學;內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/55;C12P7/6409;C12R1/865
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 楊慧林

本發明涉及一株類母乳脂肪組成的釀酒酵母菌株及其構建方法與應用。本發明所述釀酒酵母工程菌以釀酒酵母為宿主菌，通過敲除自身天然的脂肪酸去飽和酶和將異源脂肪酸去飽和酶整合表達至所述宿主菌，同時強化脂肪酸合成前體乙酰輔酶A合成途徑，得到所述釀酒酵母工程菌。本發明通過對脂肪酸合成途徑的相關基因進行強化，以達到高產類母乳脂肪酸組成脂肪酸的效果，使得釀酒酵母生產的脂肪酸組成接近于母乳，主要為C16:0,C18:1和C18:2的比例。

技術領域

本發明屬于生物代謝技術領域，尤其是指一株類母乳脂肪組成的釀酒酵母菌株及其構建方法與應用。

背景技術

母乳是嬰幼兒最好的食物，為嬰幼兒提供了理想、均衡的飲食并可以保護嬰兒、防止疾病的發生，母乳喂養是嬰兒最好的喂養方式，但是由于某些原因導致無法使用母乳進行喂養，以母乳為黃金標準的適合嬰兒的嬰幼兒配方奶粉成為替代母乳的理想產品。母乳中的脂肪酸組成及其含量也一直是相關研究的熱點，嬰幼兒配方奶粉通過添加或提取動物及植物油/乳脂中的某些組分，使其接近于母乳中的組分組成，隨著研究的不斷深入和細化，動物及植物油/乳脂中由于其固有的組分組成已經無法適應人們的需求，無法按照人們的需求進行改變。通過基因工程改造工業生產菌株生產特定脂質組成具有巨大的潛力，可以生產出滿足人們需求的產物，同時采用基因工程法構建基因工程菌株從頭合成產物其具有低成本、原料不受限制、提取過程簡單、無季節性、生產時間短，對環境污染小等諸多優點，從而受到廣大學者的青睞。

目前主要使用動物乳和植物油對母乳脂肪酸及其組成進行模擬，在很大程度上受到動物乳和植物油組成與時空的約束，微生物發酵法具有可持續性、綠色環保的社會經濟效益，采用微生物發酵法生產類母乳脂肪酸組分是一種擁有巨大潛力的母乳脂質合成方式。由于微生物中脂肪酸組成與母乳中差異較大，目前，未有關于微生物發酵法以葡萄糖為底物合成類母乳脂肪酸組成菌株的相關報道，因此本研究以構建可以合成類母乳脂肪酸組成的釀酒酵母重組菌株為最終目標進行代謝改造。

釀酒酵母是又稱面包酵母或者出芽酵母。釀酒酵母是與人類關系最廣泛的一種酵母，作為食品安全菌株已用于制作面包和饅頭等食品、釀酒工業。近年來，學者們開始研究利用釀酒酵母生產天然產物，如青蒿酸、三七皂苷等。釀酒酵母具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌體污染的概率較低等優點，因此它也在基因工程領域發揮著重要作用。然而，釀酒酵母自身脂肪酸組成與母乳相差較大。

發明內容

為解決上述技術問題，以及獲得類母乳脂肪酸組成生產工程菌株，本發明提供了一種采用Cre/loxp技術將異源脂肪酸去飽和代謝途徑整合至釀酒酵母，通過對脂肪酸合成途徑的相關基因進行強化，以達到高產類母乳脂肪酸組成脂肪酸的效果，使得釀酒酵母生產的脂肪酸組成接近于母乳，主要為C16:0,C18:1和C18:2的比例。

本發明的第一個目的在于提供一株類母乳脂肪組成的釀酒酵母工程菌，所述釀酒酵母工程菌以釀酒酵母為宿主菌，通過敲除自身天然的脂肪酸去飽和酶和將異源脂肪酸去飽和酶整合表達至所述宿主菌，同時強化脂肪酸合成前體乙酰輔酶A合成途徑，得到所述釀酒酵母工程菌。

在本發明的一個實施例中，所述宿主菌選自S.cerevisiae?CEN?PK2-1CMATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3-Δ1；MAL2-8C；SUC2；S.cerevisiae?W303?MATa；ura3-1；trp1-Δ1；leu2-3,112；his3-11；ade2-1；can1-100；S.cerevisiae?FY1679?MATa；ura3-52；trp1-Δ63；leu2-Δ1；his3-Δ200；GAL2和S.cerevisiae?BY4743?MATa；ura3-Δ0；met15-Δ0；leu2-Δ0；his3-Δ1；lys-Δ0。

在本發明的一個實施例中，所述異源脂肪酸去飽和酶的合成通路關鍵酶包括銹菌屬去飽和酶OLE1，隱桿線蟲屬來源去飽和酶fat-2基因、fat-5基因、fat-6基因和fat-7基因，以及耶氏酵母屬去飽和酶FAD2。