[發明專利]一種用于檢測貓細小病毒的引物和TaqMan探針及其應用

在審

• 申請號: 202211083435.8
• 申請日: 2022-09-06
• 公開（公告）號: CN115725788A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 李淑艷;王勇;穆苑苑;劉璇;霍欣蕊;吳海強;謝祥宇;王潤
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京盛詢知識產權代理有限公司 11901
• 代理人: 張先蓉

本發明公開了一種用于檢測貓細小病毒的引物和TaqMan探針及其應用，屬于分子生物學領域。所述引物包括上游檢測引物如SEQ ID NO：1所示，下游檢測引物如SEQ ID NO：2所示；熒光探針如SEQ ID NO：3所示。本發明利用上述引物和探針檢測貓細小病毒，用隨目的基因片段擴增而變化的熒光信號強度來快速檢測和鑒定FeChPV，克服了常規PCR檢測的不足，且具有高效、精確度、特異性和重復性高、能夠定量檢測等特點，為貓細小病毒的檢測提供了一種有效的技術手段。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種用于檢測貓細小病毒的引物和TaqMan探針及其應用。

背景技術

貓細小病毒(FPV)，是單鏈DNA病毒，可導致貓泛白細胞減少癥，是貓和其他貓科動物的一種高度傳染性和往往致命的疾病。在2019年，不列顛哥倫比亞省一家多設施貓科動物收容所在暴發急性胃腸炎(AGE)期間，在貓的糞便樣本中發現了一種新型FPV，即貓查帕病毒(FeChPV)。FeChPV屬于貓細小病毒科(hamapvovirinae亞科)，為chaphamapvovirinae屬，是一種小型、無包膜的二十面體病毒，單鏈線性DNA，基因組長度為4.0-6.0kb。具有開放閱讀框(ORF)3個，分別編碼非結構蛋白NS1(ORF1)，核蛋白NP(ORF3)和主要衣殼蛋白VP(orf2)，其中NS1編碼658個氨基酸(aa)，NP編碼508個氨基酸(aa)，VP編碼187個氨基酸(aa)。FeChPV可感染脊椎動物，如狗、貓、蝙蝠、大鼠、小鼠、猿猴、豬、鳥、火雞、孔雀、雞和袋獾，是貓腸道中最常見的病原體，流行較高。

目前，FeChPV為一種新發病毒，可導致貓的腹瀉、腹痛、發熱等。但臨床上對于貓病毒的研究大多為貓細小病毒(FPV)、貓輪狀病毒(FRV)、貓冠狀病毒(FCoV)、貓杯狀病毒(FCV)等，對FeChPV的研究很少。

臨床上已經存在一些常用的病毒檢測方法，常規的聚合酶鏈反應(PCR)，操作復雜，敏感性低，結果也只是定性的；基于SYBR Green I的實時熒光定量PCR檢測方法，結果易出現假陽性；環介導等溫擴增(LAMP)容易造成氣溶膠污染，故建立一種具有快速、高效、特異性和重現性均良好，具有直觀的反應結果等優點的臨床檢測方法，對于貓腹瀉在臨床上的監測和防控具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測貓細小病毒的引物和TaqMan探針及其應用，以解決上述現有技術存在的問題，本發明通過實時檢測，用隨目的基因片段擴增而變化的熒光信號強度來快速檢測和鑒定FeChPV，克服了常規PCR檢測的不足，且具有高效、精確度、特異性和重復性高、能夠定量檢測等特點。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種檢測貓細小病毒的引物和熒光探針，所述引物包括上游檢測引物和下游檢測引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；所述熒光探針的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。

優選的是，所述貓細小病毒為貓查帕病毒。

優選的是，所述熒光探針的5'端的報告熒光基團為FAM，3'端的猝滅熒光基團為BHQ1。

本發明還提供一種檢測貓細小病毒的試劑盒，包括上述的引物和熒光探針。

本發明還提供一種非疾病診斷目的的檢測貓細小病毒的方法，包括：利用上述的引物和熒光探針進行實時熒光定量反應，反應結束后，將模板DNA的Ct值與標準曲線對照，得到模板DNA中貓細小病毒目的基因片段拷貝濃度，基于得到的拷貝濃度判斷是否含有貓細小病毒。

優選的是，利用所述引物和熒光探針進行實時熒光定量反應的反應體系包括：2×TaqMan Fast qPCR預混液(低ROX)10μL、ddH₂O 8μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、模板1μL和0.2μL熒光探針；反應程序：94℃180s、94℃5s、60℃30s，40個循環。